一种多糖水解酶及其突变体在浒苔水解中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种多糖水解酶及其突变体在浒苔水解中的应用，所述的多糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术还提供一种优化后的多糖水解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其编码基因的核苷酸序列为SEQID NO:4。本发明专利技术所提供的多糖水解酶可以用于降解浒苔产生还原性寡糖，而其突变体与最初的酶相比，具有更高的催化效率，有更好应用前景。有更好应用前景。有更好应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种多糖水解酶及其突变体在浒苔水解中的应用


[0001]本专利技术属于蛋白酶
，具体涉及一种多糖水解酶及其突变体在浒苔水解中的应用。

技术介绍

[0002]浒苔(Ulva prolifera)隶属于石莼科、石莼属，是一种广温、广盐性的绿藻，具有很强的环境的适应能力。自2008至2021年，黄海每年都发生以浒苔为主的大规模绿潮，对浒苔进行快速处置并加以利用，引起各方面的关注。
[0003]浒苔干燥组分中含有碳水化合物(43
‑
51％)、蛋白质(26
‑
33％)、脂肪(0.2
–
0.8％)、总氨基酸(20.26
–
23.32％)等。其中碳水化合物也就是浒苔多糖含量最高。
[0004]浒苔多糖主要成分是硫酸多糖，包括硫酸化鼠李糖、糖醛酸和木糖等成分，具有独特的生物活性，在食品、生物医药、化妆品等领域都有广阔的应用前景。
[0005]浒苔藻体在水解过程中可以被蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶等多种酶破坏：这些酶大部分是非专一性酶，比如木聚糖酶，可以将木糖单元水解掉。但是非专一酶的水解效率有限，水解速度慢，且水解产物结构复杂，分子量不均一。
[0006]目前有报道从海洋生物肠道和环境微生物中分离获得能够水解硫酸多糖的多糖水解酶，但天然的多糖水解酶存在种类少，降解效率低的问题，难以实际应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种多糖水解酶及其突变体在浒苔水解中的应用，从而弥补现有技术的不足。
[0008]本专利技术首先提供一种多糖水解酶，包含有：
[0009]1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶，
[0010]2)在1)中的序列上取代、缺失、添加一个或几个氨基，由1)所衍生的蛋白酶；
[0011]编码上述多糖水解酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；本专利技术另一个方面还提供一种优化后的多糖水解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
[0012]本专利技术再一个方面还提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体中插入了上述编码多糖水解酶的核酸片段；
[0013]本专利技术还提供一种重组工程菌株，其中转化有上述的重组表达载体。
[0014]本专利技术再一个方面提供多糖水解酶的一种用途，是在降解浒苔制备还原性寡糖中的应用。
[0015]本专利技术所提供的多糖水解酶可以用于降解浒苔产生还原性寡糖，而其突变体与最初的酶相比，具有更高的催化效率，有更好应用前景。
附图说明
[0016]图1：菌株的筛选照片图；
[0017]图2：pH对酶活力的影响图；
[0018]图3：温度对酶活力的影响图；
[0019]图4：NaCl浓度对酶活力的影响图。
具体实施方式
[0020]下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细的描述。
[0021]实施例1：扩增原始多糖水解酶基因
[0022]一、分离筛选多糖水解酶产生菌
[0023]采集近岸腐烂浒苔样品，使用海水培养基培养，通过梯度稀释平板法进行初步分离培养后，使用含有浒苔水解物作为唯一碳源的平板进行定向筛选，根据平板上菌落的生长情况，初步判断菌株的降解能力。
[0024]将腐烂浒苔样品加入到适量海水中，30℃培养3
‑
5天直至完全腐烂，取上清，梯度稀释并涂布于海水营养培养基中，在30℃下培养一周，挑取单菌落进行进一步纯化。复筛进行定向筛选，将单菌落接种于浒苔水解物作为唯一碳源的平板上，在30℃静置培养一周，观察产生透明圈的时间、大小。
[0025]其中初筛营养培养基的组成如下：
[0026]葡萄糖3％、酵母粉1％、海水晶2％、琼脂2％、pH6.5；
[0027]复筛固体培养基的组成如下：
[0028]浒苔水解液、氯化铵0.3％、硫酸镁0.05％、海水晶1.5％、琼脂1.5％、pH6.5
‑
7；
[0029]其中浒苔水解液的制备方法如下：取烘干浒苔20g，加入100ml浓度为0.2mol/L的稀硫酸溶液中，115℃下酸解30
‑
50min。使用氢氧化钠中和多余硫酸，将pH调节至中性，得到浒苔水解液。
[0030]最终筛选获得了一株杆菌，命名为HT02株。该菌株该细菌能够在海水培养基中生长，革兰氏染色阴性，细杆状，不产生芽孢，菌落呈黄色，在葡萄糖蛋白胨培养基中培养不产气。参照《伯杰氏鉴定手册》，属于黄杆菌属。
[0031]实施例2：筛选获得具有水解多糖功能的酶基因
[0032]对HT02株进行基因组测序和序列比对，发现存在潜在的多糖水解酶，其编码基因的核苷酸序列如下：
[0033]ATGGTGTTCTTCAAGGACCTGTTCATCTTCAAGAGCCTGATCAAGGGCACCCTGTTCACCCTGTTCGTGAGCGGCCAGATCCTGAGGGCCCCCGGCGCCGGCGGCCCCGGCGGCGCCTACGTGGTGAGCGCCCCCGACGAGGACACCAACCCCGACATCAGCTGCCCCGCCAGCGACGAGTTCGAGAACCCCAACAGGAGCGCCGACCTGCCCAACGCCGTGAACGTGGGCACCATCGACGACAGGACCTGCTACAGCAACTACACCGAGAGCAACGTGTACGGCAAGACCTGGGGCGTGTACAACATCACCGCCGGCAGCAACCACTTCGGCGAGAGGCTGCAGCCCAGGATGGAGAGGAGCCTGAGCAGGAGCAGGGAGACCGGCATCGGCAGCTTCGCCAAGTTCACCGGCGTGTTCAGGATCCTGGAGGTGGGCGACGCCGGCAGCTTCGGCCAGGACGGCAGCTACATCATGCAGGCCAAGGGCAAGCACACCGGCGGCGGCGGCCCCAACGACCCCGCCATCTGCCTGTACCTGGCCAAGCCCGTGTACGGCGACGACGGCAACGGCAACCAGGTGAGCTTCGACATCTACGCCGAGAGGATCCTGTACAGGGGCGGCGAGGGCAGCGGCAGGGAGGTGGTGTTCCTGAAGAACGTGAACAAGAACGTGG
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多糖水解酶，其特征在于，所述的多糖水解酶包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶，2)在1)中的序列上取代、缺失、添加一个或几个氨基，由1)所衍生的蛋白酶。2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的多糖水解酶。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。4.一种多糖水解酶，其特征在于，所述的多糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。5.如权利要求4所述的多糖水解酶，其特征在于，所述的多糖水解酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑媛，盛军，纪晓峰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：