本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种人重组WRN蛋白及其表达和纯化的方法，本发明专利技术提供的人重组WRN蛋白，具有显著的DNA解旋功能，可以用于人重组WRN抑制剂的筛选和评价，人重组WRN蛋白的表达和纯化方法包括人重组WRN蛋白表达长度设计、细胞表达载体的构建、人重组WRN蛋白的表达、人重组WRN蛋白的纯化以及人重组WRN蛋白的鉴定等步骤。组WRN蛋白的鉴定等步骤。
【技术实现步骤摘要】
一种人重组WRN蛋白及其表达和纯化的方法
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种人重组WRN蛋白及其表达和纯化的方法，本专利技术提供的人重组WRN蛋白，具有显著的DNA解旋功能，可以用于人重组WRN抑制剂的筛选和评价。
技术介绍
[0002]人重组WRN,Werner综合征蛋白(Werner syndrome protein)是RecQ家族DNA解螺旋酶的一种。RecQ解螺旋酶广泛存在于原核、真核生物和病毒体内，其在DNA复制、重组、修复及维护端粒的稳定等方面都发挥了关键的作用。在人体中有5种RecQ解螺旋酶，分别是RecQ1、BLM(RecQ2)、人重组WRN(RecQ3)、RecQ4、RecQ5。RecQ解旋酶有一个共同的解旋酶域。人重组WRN是RecQ家族唯一一个既有核酸外切酶结构域又有解旋酶结构域。在正常细胞中，以人重组WRN为主的RECQ家族解旋酶与错配修复蛋白共同修复基因错配和非典型DNA二级机构，维持细胞的正常增殖与存活。微卫星(microsatellite，MS)广泛分布在原核和真核生物的基因组中，是短的串联重复序列，由2
‑
6个核苷酸组成，通常重复15
‑
60次。微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是由错配修复通路基因沉默或失活导致的DNA错配修复受损引起的，被证明仅在肿瘤细胞中存在，其中结肠癌(15％)、胃癌(22％)、子宫内膜癌(20
–
30％)和卵巢癌(12％)中都检测为MSI。MSI细胞中，基因错配和DNA非典型二级结构出现增多，因为缺乏错配修复蛋白，只能依赖人重组WRN为主的解旋酶进行基因修复，保证细胞的增殖与存活。因此，人重组WRN的抑制被认为与MSI有对该类细胞的合成致死(synthetic lethal，LC)作用，是一个兼具安全性和有效性的抗癌新靶点。
[0003]目前国内外对人重组WRN抑制剂的开发还在起步阶段，商品化的人重组WRN蛋白只表达了该蛋白HRDC(Helicase
‑
and
‑
Ribonuclease D/C
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Terminal)结构域，而发挥其解旋功能的解旋酶域还未有商品化蛋白出售，无法用来进行化合物评价。该蛋白表达纯化的方法目前鲜有报道，对表达长度和表达体系条件的选择非常苛刻。
技术实现思路
[0004]方案1.一种人重组WRN蛋白，其中所述的人重组WRN蛋白的长度至少包括SEQ ID No.6所示的长度。
[0005]方案2.根据方案1所述的人重组WRN蛋白，其中所述的人重组WRN蛋白选自由以下组成的组：
[0006](1)SEQ ID No.1所示的人重组WRN蛋白；
[0007](2)SEQ ID No.2所示的人重组WRN蛋白；
[0008](3)SEQ ID No.3所示的人重组WRN蛋白；
[0009](4)SEQ ID No.4所示的人重组WRN蛋白；
[0010](5)SEQ ID No.5所示的人重组WRN蛋白；
[0011](6)SEQ ID No.6所示的人重组WRN蛋白；
[0012]方案3.一种人重组WRN蛋白表达和纯化的方法，具体步骤为：
[0013]S1，人重组WRN蛋白表达长度设计；
[0014]S2，细胞表达载体的构建；
[0015]S3，人重组WRN蛋白的表达；
[0016]S4，人重组WRN蛋白的纯化；
[0017]S5，人重组WRN蛋白的鉴定。
[0018]方案4.根据方案3所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，其特征在于步骤S1中根据人重组WRN蛋白序列，设计人重组WRN蛋白表达长度，包括人重组WRN蛋白自身氨基酸长度，以及C端用于蛋白纯化的TEV
‑
His序列；对人重组WRN完整核苷酸序列进行表达体系密码子优化，合成含有人重组WRN完整核苷酸序列的质粒pfastbac1
‑
N
‑
his
‑
TEV
‑
WRN。
[0019]方案5.根据方案4所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，所述人重组WRN蛋白自身氨基酸长度选自SEQ ID No.1
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SEQ ID No.6，优选SEQ ID No.1。
[0020]方案6.根据方案3所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，其特征在于步骤S2中细胞表达载体的构建是以含有人重组WRN基因完整核苷酸序列的质粒为模板，设计引物进行PCR扩增，PCR产物与酶切后的载体进行连接，转化感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆后测序，质粒抽提得到重组质粒，使用重组质粒，在宿主中进行扩增，分离抽提得到细胞转染用的重组杆状病毒质粒。
[0021]方案7.根据方案6所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，其特征在于所述酶为EcoRI/XhoI，所述载体为pFastbac1，所述感受态细胞为DH5a感受态细胞，所述重组质粒为pFastbac，所述宿主为DH10Bac，所述杆状病毒质粒为Bacmid DNA。
[0022]方案8.根据方案6所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，其中所述细胞表达载体为真核细胞，所述真核细胞优选昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞，更优选昆虫细胞。
[0023]方案9.根据方案3所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，其特征在于步骤S3中人重组WRN蛋白的表达是利用重组杆状病毒质粒，转染昆虫细胞制备病毒杆菌，并传代制备P2病毒；使用P2病毒对感染细胞的条件进行优化，按照每个条件表达后取样进行Western Blotting对比选取最优条件进行蛋白表达。
[0024]方案10.根据方案3所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，其特征在于步骤S4中人重组WRN蛋白的纯化是将优化条件下感染的细胞用裂解液重悬，超声裂解破碎细胞，收集上清液进行镍柱纯化；镍柱纯化后的样品使用TEV蛋白酶进行酶切，切除蛋白上His标签后进行二次镍柱纯化，进一步去除与镍柱非特异结合的杂蛋白；二次镍柱纯化后的蛋白样品用分子筛柱进行纯化；对分子筛纯化后的蛋白样品进行第三次镍柱纯化，最终得到人重组WRN蛋白的终产物。
[0025]方案11.根据方案3所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，其特征在于步骤S5中人重组WRN蛋白的鉴定是对S4中所得到的终产物进行定量、跑胶分析和质谱分析，确定蛋白含量以及纯度，并对其功能进行鉴定。
[0026]12.方案1所述的人重组WRN蛋白在人重组WRN抑制剂筛选中的应用。
[0027]专利技术详述
[0028]在本专利技术中所使用的缩写和英文表述具有以下含义。
[0029]WB：Western Blotting，蛋白质印迹
[0030]人重组WRN：Werner Syndrome Helicase，沃纳综合征解旋酶
[0031]PCR:Polymera本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种人重组WRN蛋白，其中所述的人重组WRN蛋白的长度至少包括SEQ ID No.6所示的长度。2.根据权利要求1所述的人重组WRN蛋白，其中所述的人重组WRN蛋白选自由以下组成的组：(1)SEQ ID No.1所示的人重组WRN蛋白；(2)SEQ ID No.2所示的人重组WRN蛋白；(3)SEQ ID No.3所示的人重组WRN蛋白；(4)SEQ ID No.4所示的人重组WRN蛋白；(5)SEQ ID No.5所示的人重组WRN蛋白；(6)SEQ ID No.6所示的人重组WRN蛋白。3.一种人重组WRN蛋白表达和纯化的方法，具体步骤为：S1，人重组WRN蛋白表达长度设计；S2，细胞表达载体的构建；S3，人重组WRN蛋白的表达；S4，人重组WRN蛋白的纯化；S5，人重组WRN蛋白的鉴定。4.根据权利要求3所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，其特征在于步骤S1中根据人重组WRN蛋白序列，设计人重组WRN蛋白表达长度，包括人重组WRN蛋白自身氨基酸长度，以及C端用于蛋白纯化的TEV
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His序列；对人重组WRN完整核苷酸序列进行表达体系密码子优化，合成含有人重组WRN完整核苷酸序列的质粒pfastbac1
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N
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his
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TEV
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WRN。5.根据权利要求4所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，所述人重组WRN蛋白自身氨基酸长度选自SEQ ID No.1
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SEQ ID No.6，优选SEQ ID No.1。6.根据权利要求3所述的人重组WRN蛋白表达和纯化方法，其特征在于步骤S2中细胞表达载体的构建是以含有人重组WRN基因完整核苷酸序列的质粒为模板，设计引物进行PCR扩增，PCR产物与酶切...
【专利技术属性】
技术研发人员：王永辰，彭鹏，
申请(专利权)人：药捷安康南京科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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