一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶、基因、载体、工程菌、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程和蛋白质表达技术领域，具体涉及一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶、基因、载体、工程菌、制备方法及应用，所述环氧水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术构建了含有优化后基因的重组质粒pCold II

【技术实现步骤摘要】
一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶、基因、载体、工程菌、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质表达
，尤其涉及一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶、基因、载体、工程菌、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]光学纯的环氧化物和邻二醇对映体是有机合成中具有商业高附加值的手性构件，是制备多种重要生物活性化合物的关键中间体，如扁桃酸、氟西汀、氨基醇、γ
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内酯类等。医药、农药及精细化工等相关领域的快速发展使得手性环氧化物和邻二醇市场需求量逐年攀升，如何高效而又绿色的制备这两类手性化合物已成为当前的研究热点。其中，苯基缩水甘油醚(phenyl glycidyl ether,PGE)是合成β阻滞剂、β分泌酶裂解酶抑制剂以及一些神经元保护分子的重要手性砌块。同化学合成法(如Sharpless和Jacobsen不对称环氧化等)相比，利用辅因子非依赖性的环氧水解酶在温和的条件下催化制备PGE的R与S两种对映体是最具发展潜力的方法之一。
[0003]环氧水解酶(epoxide hydrolases,EC 3.3.2.
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)能催化环氧化物水解开环生成对应分子结构的邻二醇，属于醚水解酶类。根据环氧水解酶的催化特性以及环氧化物的结构特征，其介导的水解方式主要有三种：(1)水解动力学拆分，即对映选择性环氧水解酶特异性催化外消旋(racemic,rac
‑
)环氧化物中某一对映体优先水解为相应邻二醇，保留单一构型环氧化物。(2)对映归一性水解，当单一或两种催化剂分别优先作用于外消旋环氧化物的两个对映体的C
α
和C
β
时，可获得高对映体纯度和高产率邻二醇。(3)去对称性水解，即环氧水解酶专一性催化内消旋环氧化物的某一碳原子不对称水解为相应(S,S)
‑
邻二醇或者(R,R)
‑
邻二醇。
[0004]目前获取(R)
‑
PGE的方法主要是化学合成法，但化学合成法需要昂贵的配体，提高了成本。为解决这一问题，许多研究者通过环氧水解酶催化生成(R)
‑
PGE，如Priya Saini等(World Journal of Microbiology and Biotechnology,2017,33(5):82)以及Kai Wu等(Applied Microbiology&Biotechnology,2015,99(22):9511
‑
9521)，他们获得(R)
‑
PGE的得率分别为34％和44.3％，但是，此(R)
‑
PGE的得率仍有待提升。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶、基因、载体、工程菌、制备方法及应用，以解决现有酶的催化活性和对映选择性较低，(R)
‑
PGE得率有待提升的问题。
[0006]基于上述目的，本专利技术提供了一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶，所述环氧水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]所述氨基酸序列是经替换、添加或遗失一个或若干氨基酸残基得到的，且编码具有环氧水解酶活性的由所述氨基酸序列衍生的蛋白质。本申请的环氧水解酶具备：同所限
定的氨基酸序列拥有≥98％同源性且具有环氧水解酶活性的蛋白质。
[0008]本专利技术还提供一种编码所述费氏链霉菌来源的环氧水解酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供一种含所述基因的表达载体和工程菌。
[0010]所述工程菌是以真菌或细菌为宿主构建表达得到的。
[0011]本专利技术还提供所述费氏链霉菌来源的环氧水解酶的工程菌的制备方法，包括如下步骤：
[0012]步骤一、依据E.coli BL21DE3系列菌株的密码子偏好性进行密码子优化以得到如SEQ ID NO.2所示sfeh1基因的核苷酸序列；
[0013]步骤二、以步骤一得到的sfeh1基因的核苷酸序列为模板进行PCR扩增，将扩增产物连接表达载体pCold II得到重组表达质粒pCold II
‑
sfeh1；
[0014]步骤三、将重组表达质粒pCold II
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sfeh1导入E.coli BL21DE3中，得到待表达的工程菌E.coli/sfeh1。
[0015]本专利技术还提供所述环氧水解酶、编码所述费氏链霉菌来源的环氧水解酶的基因、含所述基因的表达载体、含所述基因的工程菌在手性生物催化中的应用。
[0016]优选的，所述应用是以所述环氧水解酶和/或表达所述环氧水解酶的工程菌为催化剂，以rac
‑
PGE为底物，在20～35℃下，进行不对称催化反应。
[0017]进一步优选的，rac
‑
PGE在400mmol/L的浓度条件下，以每mmol/L对应0.2
‑
0.3U的比例添加所述催化剂，在27℃，220rpm下振荡反应4h。
[0018]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种Streptomyces fradiae来源的新型环氧水解酶，命名为SfEH1，其相应的基因命名为sfeh1。SfEH1底物谱广泛，尤其对含有苯基的缩水甘油醚类化合物具有较高的水解活性和对映选择性，以rac
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PGE为底物时，经冷冻干燥的菌体全细胞催化活力为0.32U/mg，以较低的细胞浓度便可以在4h以内基本完成较高浓度(400mmol/L)rac
‑
PGE的动力学拆分反应，保留(R)
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PGE，其对映体过量率(enantiomeric excess,ee)接近100％，产率为45.9％。因此，SfEH1与其重组工程菌E.coli/sfeh1具备较大的应用潜力及社会经济价值。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为本专利技术表达重组SfEH1工程菌E.coli/sfeh1的菌液PCR鉴定核酸电泳图；其中，泳道M：DNA marker(250bp)；泳道1～4：E.coli/sfeh1；
[0021]图2为本专利技术环氧水解酶SfEH1重组质粒pCold II
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sfeh1模式简图；
[0022]图3为本专利技术表达重组SfEH1工程菌E.coli/sfeh1的SDS
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PAGE图；其中，泳道M：蛋白指示条带marker；泳道1和2分别代表E.coli/pCold II的上清和沉淀；泳道3和4分别代表E.coli/sfeh1的上清和沉淀；
[0023]图4为本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种费氏链霉菌来源的环氧水解酶，其特征在于，所述环氧水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述费氏链霉菌来源的环氧水解酶，其特征在于，所述氨基酸序列是经替换、添加或遗失一个或若干氨基酸残基得到的，且编码具有环氧水解酶活性的由所述氨基酸序列衍生的蛋白质。3.一种编码权利要求1所述费氏链霉菌来源的环氧水解酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种含权利要求3所述基因的表达载体。5.一种含权利要求3所述基因的工程菌。6.根据权利要求5所述基因的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以真菌或细菌为宿主构建表达得到的。7.表达权利要求1所述费氏链霉菌来源的环氧水解酶的工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、依据E.coliBL21DE3系列菌株的密码子偏好性进行密码子优化以得到如SEQ ID NO.2所示sfeh1基因的核苷酸序列；步骤二、以步骤一得到的sfeh...

【专利技术属性】
技术研发人员：李闯，刘志刚，邬敏辰，许耀辉，李剑芳，王芯怡，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：