一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用，属于分子生物学技术领域。所述三磷酸核苷水解酶为GajB蛋白或GajB'蛋白，在金属离子和DNA同时存在的条件下，使用所述三磷酸核苷水解酶水解三磷酸核苷；所述GajB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述GajB'蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述金属离子为镁离子、锰离子、钙离子。本发明专利技术通过在GajB蛋白或GajB'蛋白的氨基端接入识别标签，并选择合适的纯化方法提高了三磷酸核苷水解酶的纯度。该三磷酸核苷水解酶可应用于DNA检测、DNA加工、基因编辑、基因工程等领域。基因工程等领域。基因工程等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用。

技术介绍

[0002]三磷酸核苷是核苷酸的几种结构之一，根据核苷酸分子中的磷酸基个数，核苷酸分子结构有一磷酸核苷(NMP)、二磷酸核苷(NDP)及三磷酸核苷(NTP)。核苷是由嘌呤或嘧啶碱基与核糖形成的缩合物，这种缩合物的核糖上的五位羟基再与三聚磷酸成脂，就形成三磷酸核苷，同时，它们也是核苷酸的合成底物。三磷酸核苷是一种含有三个磷酸基团的核苷酸，自然界常见的型态包括三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸胸腺苷(TTP)以及三磷酸尿苷(UTP)等。这些分子中包含一个核糖，若是将核糖替换常去氧核糖，那么会使核甘三磷酸变成去氧核苷三磷酸(dNTP)，如去氧腺苷三磷酸(dATP)、去氧鸟苷三磷酸(dGTP)等。
[0003]核苷三磷酸是一种分子，含有与5
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碳糖结合的氮基，三个磷酸基团与糖结合。它们是DNA和RNA的构建模块，在体内，核苷三磷酸盐也作为细胞反应的能量来源，并参与信号传导途径。核苷三磷酸不能被很好的吸收，因此它们通常在细胞内合成。
[0004]三磷酸核苷水解可释放能量，例如三磷酸腺苷(ATP)，它是由腺嘌呤、核糖和3个磷酸基团连接而成，水解时释放出能量较多，是生物体内最直接的能量来源。ATP中的高能磷酸键断裂，ATP水解成ADP+Pi(游离磷酸基团)+能量，高能磷酸键水解时释放的能量多达30.54kJ/mol。因此，三磷酸核苷水解所释放出来的能量可帮助蛋白质发挥作用，比如它可以帮助解旋酶或其他蛋白质在DNA是在DNA上移动。
[0005]2018年，Doron S等人在《Systematic discovery of antiphage defense systems in the microbial pangenome》(Doron S,Melamed S,Ofir G,et al.Science,2018,359(6379))中报道了Gabija细菌防御系统，它包含GajA蛋白和GajB蛋白两个组分，能有效地抵抗多种噬菌体对细菌的入侵。后续研究发现GajA蛋白和GajB蛋白对Gabija系统防御功能的发挥都是不可或缺的，二者必需协同作用。最近，GajA蛋白的功能已被解析(Cheng and Zhu et al.,A nucleotide
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sensing endonuclease from the Gabija bacterial defense system.Nucleic acids research,2021,49(9))，但它的活性受核苷酸抑制且其周转率比较差，单独的GajA蛋白不足以抵抗噬菌体入侵，GajB可能协助或促进GajA发挥作用，共同实现破坏噬菌体入侵的目的。但GajB如何与GaiA协同工作仍不清楚，GajB的功能也未被揭示。因此，GajB功能的解析将有利于理解Gabija细菌防御系统的作用机制，也将促进GajB的开发利用和Gabija系统体外功能的实现及应用。

技术实现思路

[0006]为了研究GajB蛋白的功能，专利技术人做了大量的实验研究，发现GajB蛋白并没有解旋酶活性，但却具有催化三磷酸核苷水解的活性，可为蛋白质运动提供能量；即本专利技术的发
明人发现了GajB蛋白的一种新的功能和用途，GajB蛋白可以作为三磷酸核苷水解酶使用。专利技术人在进一步研究过程中，还发现了另一种全新的三磷酸核苷水解酶，取名为GajB'蛋白，它与GajB蛋白相比，仅在N端多了5个氨基酸，但具有更强的三磷酸核苷特异性水解活性。专利技术人还成功克隆并建立了GajB蛋白和GajB'蛋白的表达和纯化方法，并对二者进行了功能鉴定和应用探索，发现GajB蛋白或GajB'蛋白通过与Gabija系统中另一组分GajA蛋白协同发挥作用，能够作为DNA加工、基因工程和基因编辑等领域有效的工具酶。具体地，本专利技术采用如下技术方案来实现：
[0007]一种三磷酸核苷水解酶，所述三磷酸核苷水解酶为GajB蛋白或GajB'蛋白，在金属离子和DNA同时存在的条件下，使用所述三磷酸核苷水解酶水解三磷酸核苷；所述GajB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述GajB'蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]现有技术中虽然已经公开了Gabija细菌防御系统包含GajA蛋白和GajB蛋白两个组分，具有较强的噬菌体防御功能；GajA蛋白的功能已被现有技术解析，但是GajB蛋白的功能还未见有相关研究报道。专利技术人根据现有技术，预测GajB蛋白为UvrD
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like解旋酶，它包含一个UvrD超家族结构域。然而，专利技术人在经过大量的实验研究后发现GajB蛋白并无解旋酶活性，但具有三磷酸核苷水解活性，可为蛋白质运动提供能量。GajB蛋白的这一功能彻底打破了本领域技术人员的常规认知。同时，专利技术人在研究过程中，还发现了GajB的另一种编码形式GajB'，它与GajB相比，仅在N端多了5个氨基酸，但却具有更强的三磷酸核苷水解活性。无论是GajB蛋白还是GajB'蛋白作为三磷酸核苷水解酶，都必须在金属离子和DNA同时存在下，才具有三磷酸核苷水解活性，并且，这种活性在金属离子为镁离子、锰离子、钙离子、钴离子中任一种时，活性更强。
[0009]在可选的实施方式中，所述DNA为ssDNA，所述金属离子为镁离子。
[0010]专利技术人研究了各种不同种类的DNA对三磷酸核苷水解酶活性的影响，最终发现在ssDNA和镁离子存在下，三磷酸核苷水解酶的活性最强，并且其活性不受ssDNA来源的影响。
[0011]在可选的实施方式中，所述GajB蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0012]在可选的实施方式中，所述GajB'蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。在诱导表达GajB'蛋白时，既可以直接使用SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，也可以使用先将SEQ ID No.4的核苷酸序列的N端起始密码子gtg更改为atg后的核苷酸序列。一般情况下，为了提高表达效率，选择使用将SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的N端起始密码子gtg更改为atg后的核苷酸序列。
[0013]本专利技术还提供了所述三磷酸核苷水解酶的纯化方法，包括以下步骤：
[0014]S1、GajB蛋白或GajB'蛋白表达：制备含有所述GajB蛋白的编码基因或所述GajB'蛋白的编码基因，以及识别标签的编码基因的重组载体；将所述重组载体转化到感受态细胞中培养，诱导表达，经细胞裂解后收集上清液；
[0015]S2、收集目标蛋白溶液并纯化：将步骤S1中得到的上清液通过镍柱，按浓度由低到高的顺序加入20～100mmol/L咪唑溶液洗脱，收集每一个浓度的咪唑溶液洗脱的蛋白液分别进行SDS
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PAGE电泳检测，收集纯度较高的GajB蛋白溶液或GajB'蛋白溶液，经超滤浓缩和凝胶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三磷酸核苷水解酶，其特征在于，所述三磷酸核苷水解酶为GajB蛋白或GajB'蛋白，在金属离子和DNA同时存在的条件下，使用所述三磷酸核苷水解酶水解三磷酸核苷；所述GajB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述GajB'蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述金属离子为镁离子、锰离子、钙离子、钴离子。2.根据权利要求1所述的三磷酸核苷水解酶，其特征在于，所述DNA为ssDNA，所述金属离子为镁离子。3.根据权利要求1所述的三磷酸核苷水解酶，其特征在于，所述GajB蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述GajB'蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，在诱导表达所述GajB'蛋白时，直接使用所述SEQ ID No.4的核苷酸序列或将所述SEQ ID No.4的核苷酸序列的N端起始密码子gtg更改为atg后的核苷酸序列。4.权利要求1～3任一项所述的三磷酸核苷水解酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、GajB蛋白或GajB'蛋白表达：制备含有所述GajB蛋白的编码基因或所述GajB'蛋白的编码基因，以及识别标签的编码基因的重组载体；将所述重组载体转化到感受态细胞中培养，诱导表达，经细胞裂解后收集上清液；S2、收集目标蛋白溶液并纯化：将步骤S1中得到的上清液通过镍柱，按浓度由低到高的顺序加入20～100mmol/L咪唑溶液洗脱，收集每一个浓度的咪唑溶液洗脱的蛋白液分别进行SDS
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PAGE电泳检测，收集纯度较高的GajB蛋白溶液或GajB'蛋白溶液，经超滤浓缩和凝胶过滤层析后，收集洗脱峰溶液；将所述洗脱峰溶液超滤浓缩后加入透析袋中，用透析液透析3次，收集透析后的蛋白即为目标蛋白；所述凝胶过滤层析使用的洗脱液的成分包含pH＝7.5的Tris
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HCl缓冲液，300mmol/L NaCl，0.5mmol/L DTT；所述透析液的成分包含pH＝7.5的Tris
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HCl缓冲液，100mmol/L NaCl，1mmol/L DTT，0.5mmol/L EDTA，1v/v％Triton X
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100，50v/v％甘油。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱斌，成锐，
申请(专利权)人：深圳华中科技大学研究院，
类型：发明
国别省市：