一种新内含肽及其在合成人源原弹性蛋白上的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新内含肽及其在合成人源原弹性蛋白上的应用。本发明专利技术提供了一种内含肽突变体(SEQ ID NO.1)；还提供使用内含肽突变体来制备和纯化目的分子的方法，使用内含肽变体和人源原弹性蛋白融合成高效表达的融合蛋白，并构建到表达载体pET

【技术实现步骤摘要】
一种新内含肽及其在合成人源原弹性蛋白上的应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，涉及一种新内含肽及其在合成人源原弹性蛋白上的应用。

技术介绍

[0002]弹性蛋白(ELN，elastin)是生皮组织中弹性纤维(elastic fibers)的主要成分，主要存在于韧带和脉管壁。弹性纤维与胶原纤维共同赋予组织弹性和抗张能力。弹性蛋白占真皮中总蛋白的2％，在维持皮肤弹性上起着重要作用。弹性蛋白减少是皮肤发生老化松弛、下垂和细皱纹的主要原因，随着皮肤自然老化，弹性纤维分解越来越显著。因此，弹性蛋白在化妆品、医疗、美容和日常生活具有极其重要的应用价值。人源原弹性蛋白肽链序列中含有713个以上的氨基酸。不同于胶原和角蛋白，弹性蛋白的氨基酸序列中不存在贯穿整个肽链的重复性周期结构，但是存在交替的亲水和疏水性肤段。由氧化赖氨酰形成的锁链素和开链锁链素是弹性蛋白特有的交联结构。人源原弹性蛋白(又成为弹性蛋白肽链和弹性蛋白单体)经脯氨酸和赖氨酸羟基化形成羟基化的弹性蛋白单体，并通过交联形成弹性蛋白复合物和弹性纤维。人源原弹性蛋白分子中非极性氨基酸占95％，甘氨酸含量接近总量的1/3，脯氨酸占10％，羟脯氨酸占1％；这使得人源原弹性蛋白的原核表达和纯化变得极其困难，极大地限制了弹性蛋白的生产和应用。因此亟需一种高效表达纯化人源原弹性蛋白的方法。
[0003]内含肽是一段可以催化自身从前体蛋白质中去除的氨基酸序列，插入到外显肽基因中与靶基因一起表达成为嵌合蛋白前体，再通过自催化作用从前体蛋白中切除并将两侧外显肽通过肽键连接起来成为成熟蛋白质。正因为内含肽的自剪接的性质和功能，内含肽在对蛋白的表达及修饰作用方面的应用也越来越广泛。至今，内含肽在蛋白质工程领域有着广泛的应用。这些应用包括蛋白质纯化、蛋白质连接、环肽制备以及蛋白标记等方面。其中在蛋白纯化方面的研究最为广泛和深入。但在应用内含肽时，仍存在内含肽种类少、偏好性大和效率不足的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术第一个方面的目的，在于提供一种内含肽突变体。
[0005]本专利技术第二个方面的目的，在于提供一种融合蛋白。
[0006]本专利技术第三个方面的目的，在于提供一种核酸分子。
[0007]本专利技术第四个方面的目的，在于提供一种载体。
[0008]本专利技术第五个方面的目的，在于提供一种重组细胞。
[0009]本专利技术第六个方面的目的，在于提供上述的内含肽突变体或上述的融合蛋白或上述的核酸分子或上述的载体或上述的重组细胞在蛋白表达、纯化中的应用。
[0010]本专利技术第七个方面的目的，在于提供制备目的分子的方法。
[0011]本专利技术所采取的技术方案是：
[0012]本专利技术的第一方面，提供一种内含肽突变体，所述内含肽突变体的氨基酸序列为：
[0013](a)SEQ ID NO.1；或
[0014](b)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比具有90％以上序列一致性的氨基酸序列，且具有(a)所限定的氨基酸序列所具有的功能。
[0015]本专利技术的第二方面，提供一种融合蛋白，包括本专利技术第一方面所述的内含肽突变体。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述融合蛋白还包括目的分子。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述目的分子为寡肽、多肽或者大分子蛋白。
[0018]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述大分子蛋白为人源性弹性蛋白。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述融合蛋白还包括纯化标签。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述纯化标签为亲和型标签。
[0021]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述纯化标签：His
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tag、Flag
‑
tag、c
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Myc
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tag、HA
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tag、SNAP
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tag、Halo
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Tag、Spy
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Tag、SUMO
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Tag、GST
‑
tag等。
[0022]本专利技术的第三方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子编码本申请第一方面所述的内含肽突变体或本专利技术第二方面所述的融合蛋白。
[0023]本专利技术的第四方面，提供一种载体，包含本专利技术第三方面所述的核酸分子。
[0024]本专利技术的第五方面，提供一种重组细胞，包含本专利技术第三方面所述的载体，所述细胞非植物细胞或动物细胞。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，所述细胞为原核生物或真核生物。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，所述原核生物为大肠杆菌。
[0027]本专利技术的第六方面，提供本专利技术第一方面所述的内含肽突变体或本专利技术第二方面所述的融合蛋白或本专利技术第三方面所述的核酸分子或本专利技术第四方面所述的载体或本专利技术第五方面所述的重组细胞在合成目的蛋白的应用。
[0028]本专利技术的第七方面，提供制备目的分子的方法，所述方法包括以下步骤：
[0029]S1：培养本专利技术第五方面所述的重组细胞诱导表达所述融合蛋白；
[0030]S2：收集步骤S1获得的重组细胞，破碎细胞后离心得上清液；
[0031]S3：将上清液纯化得融合蛋白后进一步切割得所述目的分子。
[0032]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S1中所述诱导表达的条件为：当重组细胞培养至OD600值为0.4
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0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1
‑
2mM后16
‑
37℃100
‑
250rpm继续培养4
‑
6h。
[0033]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S2中所述收集步骤S1获得的重组细胞的重组条件为：8000
‑
13000rpm，3～6℃离心5
‑
30min。
[0034]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S2中所述离心条件为10000
‑
15000rpm，3～6℃离心10
‑
30min。
[0035]在本专利技术的一些实施方式中，步骤S2中离心后进一步过滤，优选为使用0.4～0.5μm滤膜过滤。
[0036]在本专利技术的一些实施方式中，所述破碎菌体为压力或超声破碎。
[0037]在本专利技术的一些实施方式中，所述纯化为亲和层析。
[0038]在本专利技术的一些实施方式中，所述亲和层析柱为Ni
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NTA亲和层析柱。
DnaB的N端半胱氨酸突变成丙氨酸(SEQ ID NO.1)，因为内含肽N端的半胱氨酸C对N端切割活性是必须的，但并不适用于本申请，因此将其进一步突变成无活性的丙氨酸；从而去除内含肽N端半胱氨酸依赖性的蛋白酶活性，并应用于后续的蛋白表达和纯化应用。
[0056]SEQ ID NO.2：
[0057]CLTGDALVAVADSGRNVP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内含肽突变体，其特征在于，所述内含肽突变体的氨基酸序列为：(a)SEQ ID NO.1；或(b)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比具有90％以上序列一致性的氨基酸序列，且具有(a)所限定的氨基酸序列所具有的功能。2.一种融合蛋白，其特征在于，包括权利要求1所述的内含肽突变体。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括目的分子。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述目的分子为寡肽、多肽或者大分子蛋白。5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的内含肽突变体或权利要求2～4任一项所述的融合蛋白。6.一种载体，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽花，江翱，张志乾，吴奕瑞，王海梅，邱益，刘月月，罗元廷，胡玉成，
申请(专利权)人：广州市乾相生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：