重组TET酶MBD2-NgTET1及其在提高TET酶氧化产物中5caC占比的应用制造技术

本发明专利技术提供了增强TET酶活性的重组蛋白结构域，为DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1

【技术实现步骤摘要】
重组TET酶MBD2
‑
NgTET1及其在提高TET酶氧化产物中5caC占比的应用
[0001]本申请是于2021年10月18日提交的申请号为202111207210.4、名称为“重组蛋白结构域及其编码DNA、增强TET酶及全基因组DNA甲基化检测方法”的专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术专利涉及重组蛋白结构域及其编码DNA、增强TET酶及全基因组DNA甲基化检测方法，属于生物


技术介绍

[0003]DNA胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA中最常见的碱基修饰方式，约占所有胞嘧啶的1%
‑
8%，被称为“第五种碱基”。DNA甲基化与染色质状态和基因转录活跃程度具有明显的相关性，是预测基因表达水平的有效依据。因此，DNA甲基化水平检测是临床疾病诊断的有效手段。现有的DNA甲基化检测技术主要是依赖于反向筛选的重亚硫酸盐转化法，其原理是利用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶，再通过PCR扩增转变成胸腺嘧啶。这种方法具有DNA损伤大、背景噪音高和准确性低等缺陷。近年来，酶转化法甲基化检测技术因为具备DNA损伤小、背景噪音低、准确性高和数据质量好等优点而成为DNA甲基化检测领域的重要关注点。
[0004]DNA羟甲基化酶TET是真核生物中普遍存在的一种α
‑
酮戊二酸（α
‑
KG）和Fe2+依赖的双加氧酶，在生物进化过程中具有高度的保守性。TET酶是DNA去甲基化过程的关键蛋白，可以将5mC通过三步氧化反应（5mC
‑
5hmC
‑
5fC
‑
5caC）转变成5caC。目前的酶转化法DNA胞嘧啶甲基化检测技术都是依赖于TET酶催化甲基化胞嘧啶的能力，TET蛋白是酶转化法DNA甲基化检测技术的核心蛋白，具有极大的工程改造和应用价值。获得一种高活性的重组TET酶突变体，对于体外DNA甲基化技术的发展和在疾病诊断领域的应用，具有重要的价值。
[0005]本专利技术提供了增强TET酶活性的重组蛋白结构域，为DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1
‑
4的氨基酸序列如SEQ ID 1
‑
4所示。通过MBD与TET酶融合形成的重组蛋白MBD
‑
TET可以显著增强TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT的氧化活性。此外，本专利技术还提供了适用于MBD
‑
TET的反应缓冲液和简便快速的高通量DNA甲基化检测流程，能够有效增强MBD
‑
TET对5mC的氧化活性，提高基于TET酶氧化反应的DNA甲基化检测技术的灵敏度和准确性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种可增强TET酶活性的重组蛋白结构域。
[0007]所述的重组蛋白结构域是DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1
‑
4氨基酸序列如SEQ ID 1
‑
4所示，其中MBD1效果最优。
[0008]以及上述MBD的编码DNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.10
‑
13中任一项所示。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供一种增强TET酶，为在NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、
hTET1CD或hTET2CDT的氨基端通过GGGS连接肽连接上述的重组蛋白结构域MBD1、MBD2、MBD3或MBD4，NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD、的hTET2CDT氨基酸序列分别如SEQ ID 5
‑
9所示，其中NgTET1最优。
[0010]本专利技术的又一目的是提供一种全基因组DNA甲基化检测方法，其特征在于其步骤包括：（1）采用上述的增强TET酶对模板DNA进行氧化；（2）还原剂处理，碱中和；（3）DNA回收；（4）DNA文库构建。
[0011]优选的，步骤（1）中所述的氧化反应时加入TET酶反应缓冲液，该TET酶反应缓冲液可以提高TET酶氧化5mC反应中5caC产物的占比。
[0012]优选的，所述TET酶反应缓冲液含有：1
‑
100 mM 3
‑
(N
‑
吗啉基)丙磺酸钠盐、1
‑
100 mM双(2
‑
羟乙基)氨基
‑
三(羟甲基)甲烷、1
‑
100 mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1
‑
300 mM氯化钠、0.1
‑
10 mM抗坏血酸、0.1
‑
10 mM柠檬酸、0.1
‑
20 mMα
‑
酮戊二酸、0.1
‑
20 mM 1,3
‑
丙酮二羧酸、0.1
‑
20 mM三磷酸腺苷、0.1
‑
10 mM四氟对苯醌、0.1
‑
10 mM四氯对苯醌、 0.1
‑
10 mM四溴对苯醌、0.1
‑
10 mM四碘苯醌、0.01
‑
2 mM三(2
‑
羧乙基)膦、0.01
‑
2 mM二硫苏糖醇的一种或多种。
[0013]优选的，所述TET酶反应缓冲液还含有铁盐化合物。
[0014]优选的，所述铁盐化合物的使用浓度为0.1
‑
50 mM，其中1
‑
10 mM最优。
[0015]优选的，所述铁盐化合物为硫酸亚铁、乙二胺硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、柠檬酸亚铁、氯化亚铁、2,6
‑
双（1,1
‑
双（2
‑
吡啶）乙基）吡啶
‑
氧化铁络合物（[Fe
IV
(O)(Py5Me2H)]2+
）中的一种或数种，其中硫酸亚铁和[Fe
IV
(O)(Py5Me2H)]2+
最优。
[0016]优选的，所述TET酶反应缓冲液中还包括0.001
‑
1%浓度的过氧化氢和0.001
‑
1%浓度的高锰酸钾。
[0017]优选的，步骤（1）中所述的氧化反应的反应温度为10
‑
40℃，其中30
‑
40℃最优。
[0018]优选的，步骤（1）中所述的氧化反应的反应时间为0.5
‑
2 h。
[0019]优选的，步骤（2）中所述的还原剂包括氢化铝锂、氢化硼锂、醋酸硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝、三乙基硼氢化锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2
‑
甲基吡啶硼烷、硼氢化钠、氨硼烷锂、吡咯烷并硼氢化锂、硼烷乙二胺、硼烷二甲胺、硼烷吗啉络合物、硼烷三苯基膦、硼烷二苯基膦、硼烷三乙胺、4
‑
甲基吗啉硼烷、硼烷三甲胺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组TET酶MBD2
‑
NgTET1，其特征在于：所述重组TET酶MBD2
‑
NgTET1为序列如SEQ ID No.2所示的重组蛋白结构域MBD2通过GGGS连接肽连接序列如SEQ ID No.5所示的NgTET1蛋白。2.权利要求1所述的重组TET酶MBD2
‑
NgTET1在提高TET酶氧化产物中5caC占比的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于其步骤包括：（1）采用权利要求1所述的重组TET酶对模板DNA进行氧化；（2）还原剂处理，碱中和；（3）DNA回收，回收产物构成全基因组DNA甲基化检测文库；其中步骤（1）中添加TET酶反应缓冲液，所述TET酶反应缓冲液含有：1
‑
100 mM 3
‑
(N
‑
吗啉基)丙磺酸钠盐、1
‑
100 mM双(2
‑
羟乙基)氨基
‑
三(羟甲基)甲烷、1
‑
100 mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1
‑
300 mM氯化钠、0.1
‑
10 mM抗坏血酸、0.1
‑
10 mM柠檬酸、0.1
‑
20 mMα
‑
酮戊二酸、0.1
‑
20 mM 1,3
‑
丙酮二羧酸、0.1
‑
20 mM三磷酸腺苷、0.1
‑
10 mM四氟对苯醌、0.1
‑
10 mM四氯对苯醌、 0.1
‑
10 mM四溴对苯醌、0.1
‑
10 mM四碘苯醌、0.01
‑
2 mM三(2

【专利技术属性】
技术研发人员：侯策，韦磊，江翱，陈晶晶，黄开瑜，滕以刚，曹振，宋东亮，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：