携带趋化因子受体且靶向MSLN抗原的CART免疫细胞的制备及其用途制造技术

本发明专利技术属于基因工程和肿瘤免疫技术领域，涉及一种更易迁移到肿瘤组织的免疫细胞。本发明专利技术的T细胞表达靶向肿瘤细胞MSLN的嵌合抗原受体CAR及携带CCR2b/CCR4趋化因子受体，CAR包含CD8α信号肽、靶向MSLN的scFv、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4

【技术实现步骤摘要】
携带趋化因子受体且靶向MSLN抗原的CAR T免疫细胞的制备及其用途


[0001]本专利技术属于基因工程和肿瘤免疫
，涉及携带趋化因子受体且靶向MSLN抗原的CAR T免疫细胞的制备及其用途，具体涉及一种特异靶向MSLN抗原且表达CCR2b/CCR4趋化因子受体的CAR T免疫细胞的制备及用途。

技术介绍

[0002]癌症是全世界范围内主要致死因素之一，危害着人类的健康与生命。最新的全球肿瘤统计显示，2018年癌症新增病例1819万，癌症死亡病例960万。致死率排名靠前的分别为肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌，占到了所有癌症死亡比例的二分之一。肿瘤的传统治疗方式包括手术、化疗、放疗等，虽然能够杀死肿瘤细胞，但它们有很大的局限性。化疗、放疗针对的是增殖率高的细胞，但却不能区分恶性细胞和在正常生理条件下增殖的其他组织，无法选择性的针对恶性肿瘤细胞，在药物剂量上是过量的，带来了不可避免的副作用。靶向治疗虽然解决了一部分患者的问题，但适应群体小且易产生耐药性。细胞免疫治疗是继上述疗法后的一种极具疗效与前景的新治疗手段。自2017年8月首次批准抗CD19CAR T治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)以来，如今已经有3款细胞治疗药物经FDA批准上市。然而，在实体肿瘤中看到的治疗效果并不明显，其原因与缺乏肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA)、T细胞的存活及扩增不足、T细胞向肿瘤组织的迁移效率低和免疫抑制的肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)等因素有关。
专利
技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种特异靶向MSLN抗原且表达CCR2b/CCR4趋化因子受体的CAR T免疫细胞的制备及用途。
[0004]CAR T治疗血液瘤和实体瘤的效果差异显著，造成这种疗效差异的首要原因就是实体瘤组织特有的肿瘤微环境抑制了CAR T细胞向肿瘤组织的迁移。血液循环中CAR T细胞向肿瘤组织迁移是一个多步骤的过程，需要趋化因子的参与，当T细胞表面的趋化因子受体与肿瘤组织所分泌的趋化因子结合后，能促进免疫细胞向肿瘤的迁移。
[0005]基于上述思路，本申请将CCR2b/CCR4与在NSCLC高表达间皮素(mesothelin,MSLN)的单链抗体融合构建成Msln
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CCR2b/CCR4
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CAR共表达载体，通过慢病毒感染CD3 T细胞，制备Msln
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CCR2b/CCR4
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CAR T细胞。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，包含CD8α信号肽、靶向MSLN的scFv、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4
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1BB共刺激域及CD3ζ信号传导域。
[0007]本专利技术中，CAR包含胞外域、铰链域、跨膜域及胞内域。较好的，本专利技术的嵌合抗原受体包括：CD8α信号肽、靶向MSLN的scFv、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4
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1BB共刺激域、CD3ζ信号传导域、P2A剪切信号肽、CCR2b/CCR4趋化因子受体。
[0008]更好的，所述的靶向MSLN的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
[0009]所述的4
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1BB胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
[0010]所述的CD3ζ胞内信号传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
[0011]所述的CCR2b趋化因子受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
[0012]所述的CCR4趋化因子受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
[0013]所述的CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
[0014]所述的CD8α铰链域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
[0015]所述的CD8α跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
[0016]本专利技术还包括一种载体，所述的载体含有上述嵌合抗原受体的编码序列。
[0017]较好的，所述CD8α信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1所示；
[0018]所述靶向MSLN的scFv编码序列如SEQ ID NO:2所示；
[0019]所述CD8α铰链域的编码序列如SEQ ID NO:3所示；
[0020]所述CD8α跨膜域的编码序列如SEQ ID NO:4所示；
[0021]所述4
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1BB胞内共刺激域的编码序列如SEQ ID NO:5所示；
[0022]所述CD3ζ胞内信号传导域的编码序列如SEQ ID NO:6所示；
[0023]所述P2A剪切信号肽的编码序列如SEQ ID NO:7所示；
[0024]所述CCR2b趋化因子受体的编码序列如SEQ ID NO:8所示；
[0025]所述CCR4趋化因子受体的编码序列如SEQ ID NO:9所示。
[0026]上述嵌合抗原受体或者其编码载体，可以使用本领域的常规技术方法获得。例如，在市售的CAR质粒基础上改良，或者按照目标序列人工合成。
[0027]本专利技术还包括一种细胞，所述的细胞是表达靶向肿瘤细胞表面MSLN的嵌合抗原受体CAR，同时能够表达CCR2b/CCR4趋化因子受体的免疫细胞。
[0028]较好的，所述的细胞表达上述嵌合抗原受体。
[0029]所述的免疫细胞可以由慢病毒感染后获得。所述的慢病毒包括：CD8α信号肽、靶向MSLN的scFv、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4
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1BB共刺激域、CD3ζ信号传导域、P2A剪切信号肽、CCR2b/CCR4趋化因子受体。
[0030]较好的，所述免疫细胞为T淋巴细胞或者NK细胞。
[0031]较好的，所述的细胞中，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
[0032]所述靶向MSLN的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
[0033]所述CD8α铰链域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
[0034]所述CD8α跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；
[0035]所述4
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1BB胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
[0036]所述CD3ζ胞内信号传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
[0037]所述P2A剪切信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
[0038]所述CCR2b趋化因子受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
[0039]所述CCR4趋化因子受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
[0040]另一方面，本专利技术还提供了上述嵌合抗原受体和免疫细胞的应用，即上述嵌合抗原受体或者免疫细胞在制备治疗药物中的应用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括：CD8α信号肽、靶向MSLN的scFv、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4
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1BB共刺激域、CD3ζ信号传导域、P2A剪切信号肽、CCR2b/CCR4趋化因子受体。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的靶向MSLN的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述的4
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1BB胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；所述的CD3ζ胞内信号传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；所述的CCR2b趋化因子受体氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述的CCR4趋化因子受体氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述的CD8α铰链域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述的CD8α跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；所述的P2A剪切信号肽的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱焕章，王亚楠，赵琳，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：