一种用于抗肿瘤的新型IL-15融合蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种新型IL

【技术实现步骤摘要】
一种用于抗肿瘤的新型IL-15融合蛋白


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于抗肿瘤的新型IL-15融合蛋白。

技术介绍

[0002]人白细胞介素-15(IL-15)基因位于染色体4q31，跨度约34kb，有7个内含子和9个外显子，其mRNA长1.5～1.8kb。IL-15是一种相对分子量约为12-14kD的糖基化细胞因子。IL-15的前体分子由162个氨基酸组成，先导序列较长，为48个氨基酸残基。其成熟蛋白含有114个氨基酸，包括4个半胱氨酸残基，Cys35与Cys85、Cys42与Cys88连接，形成的两对分子内二硫键对于保持IL-15的空间构象和生物学活性起重要作用。
[0003]包括IL-15在内的细胞因子都具有广泛的免疫调节活性，IL-15作为一个有前途的抗肿瘤靶点已经被广泛研究。IL-15与IL-2虽然在一级结构上同源性很低，但二者在三级结构即空间构象上很相似，他们拥有共有的β和γ受体，但结合到不同的α受体。IL-15的作用主要是通过反式递呈方式，即IL-15与表达于抗原递呈细胞表面的IL-15Rα结合，然后与临近效应细胞表面的IL-15Rβγ复合物结合，最终激活效应细胞。IL-15能够参与调节多种免疫细胞的存活、增殖与功能，其中包括NK细胞、记忆性CD8+T细胞、DC细胞及巨噬细胞等。同时，与IL-2不同的是，IL-15不会导致激活诱导的细胞凋亡(AICD)，也不激活对免疫具有广泛抑制作用的调节性T细胞(Tregs)等优点，因此IL-15具有巨大的治疗潜力。
[0004]IL-15与其α受体有很高的亲和力，生理状态下IL-15大多与其α受体形成复合物，并增强IL-15对β和γ受体的亲和力，激活T细胞和NK细胞。研究表明，IL-15与可溶性IL-15Rα受体形成的复合物在促进记忆性CD8
+
T淋巴细胞和NT/NKT细胞增殖方面明显优于单独IL-15。因此，Cytune Pharma，Altor BioScience，博际生物医药和恒瑞医药等公司，用融合或非融合的方法将IL-15与其α受体(或其部分)形成复合物，并在动物试验中显示了良好的生物效价及稳定性。
[0005]尽管IL-15是肿瘤免疫治疗领域最有希望的候选药物之一，但是IL-15仍然有一定的不足。首先，天然的IL-15由于表达量低、纯化困难的制约，难以进行产业化，存在明显的药物开发瓶颈。因此，有必要对其分子结构进行重新设计以获得高表达和高稳定性的突变体。IL-15的作用是全身性，而不是肿瘤特异性的，易引起全身免疫副作用。
[0006]因此，本领域的技术人员致力于开发一种高活性、高稳定性的新型IL-15融合蛋白。

技术实现思路

[0007]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何提高IL-15在体内的抗肿瘤活性。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了一种新型IL-15融合蛋白，其特征在于，至少包括(1)IL-15Rα多肽、IL-15Rα多肽衍生物或其功能性片段，(2)IL-15多肽变体，(3)Fc结构域、Fc结构域衍生物或其功能性片段，(4)连接子或其衍生物，
[0009]其中，IL-15多肽变体至少包括第一连接子或其衍生物，第一连接子或其衍生物连接IL-15多肽的天然氨基端和羧基端形成环状体，并且选取N77，G78，N79，V80，T81，E82，S83，和G84组成组中的一个氨基酸残基后面的肽键作为断裂点，形成新氨基端和羧基端。
[0010]进一步的，各组分的排列顺序为IL-15Rα多肽-第二连接子-IL-15多肽变体-Fc结构域。
[0011]进一步的，各组分的排列顺序为第三连接子-Fc结构域-第二连接子-IL-15Rα多肽-IL-15多肽变体。
[0012]进一步的，第二连接子与IL-15Rα多肽或IL-15多肽变体共价连接。
[0013]进一步的，第一连接子为SEQ ID NO.1所示序列，或该序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸的衍生序列。
[0014]进一步的，第一连接子为SEQ ID NO.2所示序列，或该序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸的衍生序列。
[0015]进一步的，第三连接子为SEQ ID NO.3所示序列，或该序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸的衍生序列。
[0016]进一步的，第二连接子为SEQ ID NO.4所示序列，或该序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸的衍生序列。
[0017]进一步的，IL-15多肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，或SEQ ID NO.5所示序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸且具有IL-15多肽相同相似功能的衍生序列。
[0018]进一步的，IL-15多肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，或SEQ ID NO.6所示序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸且具有IL-15多肽相同相似功能的衍生序列。
[0019]进一步的，Fc结构域的序列如SEQ ID NO.7所示，或SEQ ID NO.7所示序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸且具有Fc结构域相同相似功能的衍生序列。
[0020]进一步的，Fc结构域或其衍生序列选自人类IgG1 Fc结构域、人类IgG2 Fc结构域、人类IgG3 Fc结构域、人类IgG4 Fc结构域所成群组的Fc结构域。
[0021]进一步的，IL-15Rα多肽的序列SEQ ID NO.8所示，或SEQ ID NO.8所示序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸且具有IL-15Rα相同相似功能的衍生序列
[0022]本专利技术另一方面还提供一种核酸序列，编码上述IL-15融合蛋白。
[0023]进一步的，包括操作性连结至编码IL-15融合蛋白的序列的启动子、转录起始信号及前导序列。
[0024]本专利技术还提供一种DNA载体，包括含有上述的核酸序列。
[0025]本专利技术提供一种宿主，包括含有如权利要求16的核酸序列。
[0026]本专利技术另一方面提供一种制备如上述的IL-15融合蛋白的方法，包括如下步骤：
[0027](1)提供上述的核酸序列，
[0028](2)收获包含步骤(1)中的核酸序列的质粒，
[0029](3)将步骤(2)中的质粒转入细胞中，
[0030](4)IL-15融合蛋白在细胞中表达。
[0031]进一步的，步骤(3)的详细步骤为：
[0032](3.1)试剂制备
[0033]A)制备G418溶液：称取250mg Geneticin
TM
加入4.5mL超纯水溶解，超纯水定容至
5mL，0.22μm滤膜过滤，-20℃保存，
[0034]B)制备PEI溶液：称取50mg PEI加入45mL超纯水溶解，1M NaOH调节pH至7.0，超纯水定容至50mL，0.22μm滤膜过滤，-20℃保存，
[0035]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型的IL-15融合蛋白，其特征在于，至少包括(1)IL-15Rα多肽、IL-15Rα多肽衍生物或其功能性片段，(2)IL-15多肽变体，(3)Fc结构域、Fc结构域衍生物或其功能性片段，(4)连接子或其衍生物，其中，所述IL-15多肽变体至少包括第一连接子或其衍生物，所述第一连接子或其衍生物连接IL-15多肽的天然氨基端和羧基端形成环状体，并且选取N77，E82，和G84组成组中的一个氨基酸残基后面的肽键作为断裂点从而形成新氨基端和新羧基端，各组分的第一排列顺序为IL-15Rα多肽-第二连接子-IL-15多肽变体-Fc结构域，或者第二排列顺序为第三连接子-Fc结构域-第二连接子-IL-15Rα多肽-IL-15多肽变体。2.如权利要求1所述的IL-15融合蛋白，其特征在于，所选取的断裂点为E82氨基酸后面的肽键。3.如权利要求2所述的IL-15融合蛋白，其特征在于，所述第二连接子与所述IL-15Rα多肽或IL-15多肽变体共价连接。4.如权利要求3所述的IL-15融合蛋白，其特征在于，在各组分的第一排列顺序中，所述第一连接子为SEQ ID NO.1所示序列，或该序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸的衍生序列，所述IL-15多肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，或SEQ ID NO.5所示序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸且具有所述IL-15多肽相同相似功能的衍生序列。5.如权利要求3所述的IL-15融合蛋白，其特征在于，在各组分的第二排列顺序中，所述第一连接子为SEQ ID NO.2所示序列，或该序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸的衍生序列，所述IL-15多肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，或SEQ ID NO.6所示序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸且具有所述IL-15多肽相同相似功能的衍生序列。6.如权利要求5所述的IL-15融合蛋白，其特征在于，所述第三连接子为SEQ ID NO.3所示序列，或该序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸的衍生序列。7.如权利要求1-6任一项所述的IL-15融合蛋白，其特征在于，所述第二连接子为SEQ ID NO.4所示序列，或该序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸的衍生序列。8.如权利要求7所述的IL-15融合蛋白，其特征在于，所述Fc结构域的序列如SEQ ID NO.7所示，或SEQ ID NO.7所示序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸且具有所述Fc结构域相同相似功能的衍生序列。9.如权利要求8所述的IL-15融合蛋白，其特征在于，所述Fc结构域或其衍生序列选自人类IgG1 Fc结构域、人类IgG2 Fc结构域、人类IgG3 Fc结构域、人类IgG4 Fc结构域所成群组的Fc结构域。10.如权利要求7所述的IL-15融合蛋白，其特征在于，所述IL-15Rα多肽的序列SEQ ID NO.8所示，或SEQ ID NO.8所示序列经过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸且具有所述IL-15Rα相同相似功能的衍生序列。11.一种核酸序列，编码权利要求1-6任一项的IL-15融合蛋白。12.如权利要求11所述的核酸序列，其特征在于，包括操作性连结至编码所述IL-15融合蛋白的所述序列的启动子、转录起始信号及前导序列。13.一种DNA载体，包括含有如权利要求11所述的核酸序列。14.一种宿主，包括含有如...

【专利技术属性】
技术研发人员：张维，张建军，孟万利，徐艳玲，赵耀，朴锦华，冉冬，王冀姝，
申请(专利权)人：北京志道生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：