一种水溶性提高的IL-2衍生物制造技术

本发明专利技术提供了一种水溶性提高的IL

【技术实现步骤摘要】
一种水溶性提高的IL
‑
2衍生物


[0001]本专利技术涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种水溶性提高的IL
‑
2衍生物。

技术介绍

[0002]白介素
‑
2(IL
‑
2，Interleukin
‑
2)于1976年被发现，当时被称为T细胞生长因子(T
‑
cell growth factor，TCGF)，是一种在维持T淋巴细胞和NK细胞的正常功能中起着重要作用的球状糖蛋白。天然IL
‑
2是一个具有133个氨基酸残基组成的多肽(SEQ ID NO：1)，分子量大约15kD。IL
‑
2有三个半胱氨酸残基，分别位于第58、105和125位，其中第125位的半胱氨酸不与其它半胱氨酸形成二硫键。翻译后修饰包括第3位的苏氨酸糖基化，第58位和105位半胱氨酸残基形成二硫键，并形成其功能必不可少的主要由4个α螺旋以及一些连接序列(loop)组成的高级结构(Bazan等，Science 257,410
‑
413(1992))。IL
‑
2主要由活化的T细胞生成，它能促进T细胞的增殖和分化，维持T细胞活性；刺激天然杀伤(NK)细胞的生成、增殖和活化，并诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成以及诱导和激活淋巴因子激活的杀细胞(LAK)及肿瘤浸润淋巴细胞；促进T细胞表达细胞因子和细胞溶解分子，促进B细胞的增殖(Waldmann等,Nat Rev Immunol,595<br/>‑
601(2009))等，这些细胞都有或间接有杀伤外源微生物感染细胞以及癌变细胞的作用，因此IL
‑
2有很好的抗病毒、抗癌作用和广泛的临床应用潜力。IL
‑
2通过结合IL
‑
2受体(IL
‑
2receptor，IL
‑
2R)来介导其作用，IL
‑
2受体由3个亚基组成，分别为α(CD25)、β(CD122)和γ(CD132)受体亚基，其中α受体在抑制性T细胞(Treg)表面高表达，一些内皮细胞(endothelial cells)表面也有α受体表达，而β和γ受体亚基则高表达于效应性T细胞(Teff)和NK细胞。α(CD25)、β(CD122)和γ(CD132)受体亚基可以形成αβγ异源三聚体，也可以形成βγ异源二聚体。IL
‑
2对不同受体亚基的复合物形式的亲和力是不同的，IL
‑
2对αβγ三聚体受体的亲和力是最高的，对由β和γ形成的二聚体受体的亲和力则为中等(约降低100倍)，而IL
‑
2与两种形式的受体亚基组合结合后均能传递胞内信号，发挥细胞免疫功能(Minami等，Annu Rev Immunol 11，245
‑
268(1993))。目前在临床应用中，主要利用当IL
‑
2低剂量时优先和Treg细胞表面上的高亲和力受体结合的特性，抑制体内的免疫反应。高剂量的IL
‑
2可以有效激活效应T细胞和NK细胞，进而对肿瘤产生杀伤作用。阿地白介素(HUMAN ALDESLEUKIN)，一种重组的人IL
‑
2，于1992年被FDA批准治疗转移性肾癌，1998年,该药又被批准用于治疗转移性黑色素瘤。阿地白介素是第一种被FDA批准用于肿瘤治疗的人IL
‑
2药物，尽管该药物在临床上具备良好的治疗效果，但是由于该药物水溶性差并容易聚集，从而使阿地白介素在人体内很容易产生抗药抗体(Anti
‑
drug antibody，ADA)，需要添加有毒的SDS(十二烷基硫酸钠)以增强其水溶性，而SDS长期使用会对人体造成伤害。
[0003]另外，在纯化IL
‑
2的过程中，由于野生型的IL
‑
2疏水性很高，且它的等电点靠近中性，导致IL
‑
2的水溶性较差，因此在生产过程中导致其在复性和纯化的过程中需要使用到有机相来帮助提高纯度和产量，如在文献中(MP Weir等Biochem.1987Jul1；245(1):85
‑
91.Purification and renaturation of recombinant human interleukin
‑
2)以及专利
EP0268110B1，US4992271A1中均使用反向纯化目标蛋白IL
‑
2。反相层析通常需要高浓度的有机溶剂，如乙腈，甲醇，乙醇或者异丙醇等。目前，无论是欧美发达国家还是中国境内，对于强烈污染环境的有机溶剂排放有着严格的限制。此外，有机溶剂的大量使用需要特殊的设备和车间，会导致生产成本的上升。因此，反相层析的引入成为限制IL
‑
2生产的重要因素。
[0004]同时也由于IL
‑
2水溶性差，导致在制剂配置中需要添加一些添加剂，如非离子聚合去垢剂等，以提高IL
‑
2溶解度，同时浓度也需要控制在低浓度。如专利US20120264817A1中提到使用多烯紫杉醇(docetaxel)制作成水剂；EP0268110B1中使用吐温80，葡萄糖(dextrose),SDS,PEG4000,Triton305,单硬脂酸(monostearate),且最佳浓度为0.1
‑
2mg/ml，pH6
‑
7；在专利US4992271A1中，则使用2.5％HSA或者PPF，制作成粉剂。添加剂的加入一方面增加了IL
‑
2生产的成本，另一方面，部分添加剂，如SDS，Triton
‑
305等，具有一定的细胞毒性，长期使用会对人体造成伤害，因此，IL
‑
2的不稳定性和高成本成为生产IL
‑
2的瓶颈。

技术实现思路

[0005]为克服现有技术中的问题，本专利技术的目的在于提供一种新型的IL
‑
2衍生物，在保留原有良好的活性下，通过引入特定位点的突变和在末端融合一段亲水短肽，降低其疏水性，增强亲水特性，使IL
‑
2在生产过程中全程使用水相纯化，减少环境污染，降低成本。另外，由于IL
‑
2第125位的半胱氨酸不与分子内其它半胱氨酸形成二硫键，进而可能通过分子间二硫键与另外一个野生型IL
‑
2分子形成二聚体杂质，因此，在IL
‑
2第125位引入一个突变以增加蛋白稳定性。经过改造的高水溶性的IL
‑
2为其成药后蛋白的浓度和配方的需求提供便利。其结构示意图如图1。
[0006]在第一方面，本专利技术提供一种IL
‑
2衍生物，与野生型IL
‑
2SEQ ID NO：1相比，所述IL
‑
2衍生物在SEQ ID NO：1所示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种IL
‑
2衍生物，其特征在于，与野生型IL
‑
2SEQ ID NO：1相比，所述IL
‑
2衍生物在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第19位Leu发生第一氨基酸突变，并在N末端或者C末端引入一条亲水性多肽。2.根据权利要求1所述的IL
‑
2衍生物，其特征在于，所述第一氨基酸突变是选自下组的氨基酸取代：L19R、L19Q、L19E、L19A、L19H、L19S、L19T、L19K、L19D、L19G、L19N，优选的氨基酸取代包括：L19R、L19Q、L19E、L19A、L19H。3.根据权利要求1所述的IL
‑
2衍生物，其特征在于，所述亲水多肽序列由以下的氨基酸随机组成：R、H、K、D、E、G、P、A、S、T、N、Q，优选的氨基酸组成包括：D、E、G、P、A、S、T、N、Q，更优选的包括：E、G、P、A、S、T、Q，更优选的序列如SEQ ID NO:2所示，具体为SEPATSGSETPGSEPATSGSETPG。4.根据权利要求1所述的IL
‑
2衍生物，其特征在于，所述IL
‑
2衍生物在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第125位Cys发生第二氨基酸突变；所述第二氨基酸突变为C1...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄英姿，高翔，张建军，张天赋，王礼翠，
申请(专利权)人：北京志道生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：