白介素-2突变体及其聚乙二醇修饰物和制备方法技术

本发明专利技术公开了一种白细胞介素

【技术实现步骤摘要】
白介素
‑
2突变体及其聚乙二醇修饰物和制备方法


[0001]本专利技术涉及聚乙二醇修饰的蛋白类药物，特别是聚乙二醇修饰的白介素
‑
2及其制备方法。

技术介绍

[0002]白介素
‑
2(Interleukin
‑
2，IL
‑
2)是白细胞介素大家族中的一员，为细胞免疫的基础理论研究和肿瘤生物治疗研究提供了重要基础。大量研究表明：IL
‑
2能促进T细胞、NK细胞、B细胞的分化成熟及激活其生物活性，诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的活性，还能促进许多淋巴因子如：干扰素、肿瘤坏死因子等的合成与释放以及抗体的生成。IL
‑
2在体内扩充淋巴细胞群体和提高这些细胞的效应器功能的能力使得其具有抗肿瘤效果，IL
‑
2免疫疗法成为某些转移性癌症患者的治疗选择，因此早在20世纪80年代早期，高剂量IL
‑
2已被批准用于治疗转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤。
[0003]然而，IL
‑
2在体内的半衰期短，仅为1.5小时，在临床应用中药物利用度低。同时，高剂量给药易引起免疫系统过度激活，最严重的是毛细血管渗漏综合征(Vascular Leakage Syndrome, VLS)，导致血管内液体聚集在肝肺等器官中，随后引发肺水肿和肝细胞损伤，使患者不得不中止治疗，极大地降低了病人治疗的依从性，也限制了相关疗法的进一步临床应用。
[0004]现有技术中，科研人员常运用水溶性聚合物聚乙二醇(PEG)修饰蛋白药物，PEG是一种常用的化学修饰剂，具有无毒性、良好的溶解性和低免疫原性，且相对分子量范围较宽，选择余地大等优点。其特有的线性和柔性链能够掩盖药物表面部分抗原决定中心，降低免疫原性；同时PEG修饰后增加了蛋白的大小和分子量，使其不易被肾小球过滤从而延长了在体内的半衰期。聚乙二醇化被认为是目前最常用的修饰技术和开发长效制剂的首选。但PEG偶联药物常常也会出现体内释放和药效不理想的现象。许多研究结果表明：随着PEG修饰度的提高，产物不均一性也随之增加，导致修饰后部分产物活性明显降低(王立夫等. 聚乙二醇化学修饰重组人白介素
‑
2, 1998)。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是提供一种白介素
‑
2突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
[0006]本专利技术的另一个目的是提供聚乙二醇随机修饰的白介素
‑
2突变体，所述聚乙二醇分子量为20kD，聚乙二醇为分支型。
[0007]优选的，一分子IL
‑
2突变体偶联5
‑
6分子聚乙二醇修饰剂。
[0008]V
‑
SC
‑
20k PEG是指分支型、分子量20kDa的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯修饰剂，结构如下所示：
V
‑
SCM
‑
20k PEG是指分支型20kDa聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯修饰剂，结构如下所示：本专利技术的另一个目的是提供一种上述的聚乙二醇随机修饰的白介素
‑
2的制备方法，包括如下步骤：步骤1.用100mM pH7.5
‑
8.5的磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钠缓冲液配制10
‑
20mg/mL的IL
‑
2溶液或IL
‑
2突变体溶液；步骤2. 按质量比IL
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2或IL
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2突变体：聚乙二醇=1:10
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1：30在2
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8℃的条件下反应16
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24h；步骤3. 反应结束后立即用0.5
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1M甘氨酸终止，以疏水层析色谱法纯化，收集得到高修饰度聚乙二醇化的IL
‑
2或聚乙二醇化的IL
‑
2突变体。
[0009]本专利技术聚乙二醇修饰的白介素
‑
2结构均一， PEG可以降解分离，从而实现缓释，具有降低给药频率、提高药物的生物利用度和病人的依从性等应用前景。
附图说明
[0010]图1:V
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PEG
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SC
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20k
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rhIL
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2、V
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PEG
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SCM
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20k
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rhIL
‑
2、V
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PEG
‑
SC
‑
20k
‑
G311液相纯度分析色谱图。
[0011]图2: V
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PEG
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SC
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20k
‑
G311、V
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PEG
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SCM
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20k
‑
rhIL
‑
2、 V
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PEG
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SC
‑
20k
‑
rhIL
‑
2电泳图。
[0012]图3a: V
‑
PEG
‑
SC
‑
20k
‑
rhIL
‑
2PEG结合数测定电泳图。
[0013]图3b: V
‑
PEG
‑
SC
‑
20k
‑
G311 PEG结合数测定电泳图。
[0014]图3c:V
‑
PEG
‑
SCM
‑
20k
‑
rhIL
‑
2PEG结合数测定电泳图。
[0015]图4a: V
‑
PEG
‑
SCM
‑
20k
‑
rhIL
‑
2 PEG体外缓释电泳图。
[0016]图4b: V
‑
PEG
‑
SC
‑
20k
‑
G311 PEG体外缓释电泳图。
[0017]图4c: V
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PEG
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SC
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20k
‑
rhIL
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2 PEG体外缓释电泳图。
[0018]图5：V
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PEG
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SC
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20k
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rhIL
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2、V
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PEG
‑
SCM
‑
20k
‑
rhIL
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白介素
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2突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.编码如权利要求1所示白介素
‑
2突变体的DNA序列，如SEQ ID NO：2所示。3.聚乙二醇修饰剂随机修饰的白介素
‑
2突变体，所述白介素
‑
2突变体是权利要求1所述突变体，所述聚乙二醇分子量为20kD，聚乙二醇为分支型。4.权利要求3所述聚乙二醇修饰剂随机修饰的白介素
‑
2突变体，一分子IL
‑
2突变体偶联5
‑
6分子聚乙二醇修饰剂。5.权利要求3或4所述聚乙二醇修饰剂随机修饰的白介素
‑
2突变体，所述聚乙二醇修饰剂是V
‑
SC
‑
20k PEG，其为分支型、分子量20kDa的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯修饰剂，结构如下所示：。6.权利要求3或4所述聚乙二醇修饰剂随机修饰的白介素
‑
2突变体，所述聚乙二醇修饰剂是V<...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪熙，赵百学，马永，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：