一种重组人IL2包涵体纯化复性方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人IL2包涵体纯化复性方法，其步骤包括：收集大肠杆菌表达的人IL2包涵体蛋白并洗涤；用缓冲液E溶解包涵体蛋白，向溶解的包涵体蛋白中加入缓冲液F稀释包涵体蛋白，离心收集沉淀；用缓冲液G重新溶解包涵体蛋白；人IL2包涵体蛋白柱上复性：用缓冲液H平衡Q柱，将获得的人IL2包涵体蛋白上样；缓冲液H洗杂；100％缓冲液I到100％缓冲液J的浓度梯度过柱复性，缓冲液K进一步柱上复性；100％缓冲液L到100％缓冲液M的浓度梯度线性洗脱；将洗脱后的人IL2复性蛋白透析，超滤浓缩，得到成品。本发明专利技术方法可以有效提高人IL2包涵体复性效率，采用本发明专利技术的方法，其包涵体复性效率达到60％。到60％。到60％。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人IL2包涵体纯化复性方法


[0001]本申请涉及一种重组人IL2包涵体纯化复性方法，属于蛋白表达纯化


技术介绍

[0002]白细胞介素2(IL2)又称T细胞生长因子，是由T细胞(CD4+和CD8+)和NK细胞产生，主要受抗原和T细胞受体结合刺激分泌。IL2基因位于染色体4q26
‑
28,长度3662bp,含4个外显子和3个内含子，有多种反应原件可调控IL2的表达。IL2的分子量为15.5KD，含有133个氨基酸，有糖基化，但是无糖基化修饰的蛋白并不影响蛋白的生物功能活性。IL2分子有一个链内二硫键(cys58
‑
cys105)，cys125则与IL2形成二聚体或者多聚体有关。二硫键异常配对的IL2没有生物功能活性。
[0003]IL2在大肠杆菌中通常为包涵体表达，采用稀释复性或者透析复性法其包涵体复性效率只有百分之零点几，严重影响了IL2的生产产能，为了适应市场需求，提高IL2的生产产能。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种重组人IL2包涵体纯化复性方法。
[0005]本专利技术采用的技术手段为：
[0006]一种重组人IL2包涵体纯化复性方法，其特征在于其步骤包括：
[0007](1)收集大肠杆菌表达的人IL2包涵体蛋白；
[0008](2)洗涤人IL2包涵体蛋白；
[0009](3)人IL2包涵体蛋白的两步溶解：用缓冲液E溶解包涵体蛋白，向溶解的包涵体蛋白中加入缓冲液F稀释包涵体蛋白，离心收集沉淀；用缓冲液G重新溶解包涵体蛋白；
[0010](4)人IL2包涵体蛋白柱上复性：用缓冲液H平衡Q柱，将步骤(3)获得的人IL2包涵体蛋白上样；缓冲液H洗杂；100％缓冲液I到100％缓冲液J的浓度梯度过柱复性，缓冲液K进一步柱上复性；100％缓冲液L到100％缓冲液M的浓度梯度线性洗脱；
[0011](5)将洗脱后的人IL2复性蛋白透析，超滤浓缩，得到成品；
[0012]其中缓冲液E：50
±
20mmol/LTris+6
±
0.8mol/L盐酸胍+20
±
3mmol/L巯基乙醇+1.0
±
0.1mmol/L EDTA,pH 8.0
±
0.1；
[0013]缓冲液F：50
±
20mmol/LTris+0.4
±
0.05M L
‑
Arginine Hydrochloride+2mM
±
0.2巯基乙醇+2.5
±
0.3mM GSH,0.8
±
0.1mM GSSG+1.0
±
0.1mmol/L EDTA,pH 8.0
±
0.1；
[0014]缓冲液G：50
±
20mmol/LTris+8
±
1mol/L尿素+20
±
3mmol/L巯基乙醇+1.0
±
0.1mmol/L EDTA,pH 8.0
±
0.1；
[0015]缓冲液H：50
±
20mmol/LTris+8
±
1mol/L尿素+20
±
3mmol/L巯基乙醇+1.0
±
0.1mmol/L EDTA,pH 8.0
±
0.1；
[0016]缓冲液I：8
±
1mol/L尿素+50
±
20mM Tris+1.0
±
0.1mmol/L EDTA+0.1
±
0.01M NaCl，pH 8.0
±
0.1；
[0017]缓冲液J：2
±
0.2mol/L尿素+50
±
20mM Tris+1.0
±
0.1mmol/L EDTA+0.1
±
0.01M NaCl，pH 8.0
±
0.1；
[0018]缓冲液K：5mM
±
0.5β
‑
cyclodextrin+50
±
20mM Tris+1.0
±
0.1mmol/L EDTA+0.1
±
0.01M NaCl,pH 8.0
±
0.1；
[0019]缓冲液L：50
±
20mM Tris+1.0
±
0.1mmol/L EDTA+0.1
±
0.01M NaCl,pH pH 8.0
±
0.1；
[0020]缓冲液M：50
±
20mM Tris+1.0
±
0.1mmol/L EDTA+1
±
0.1M NaCl,pH pH 8.0
±
0.1。
[0021]优选的，步骤(1)具体为离心收集诱导表达后的菌体，使用缓冲液A洗涤菌体两次，菌体沉淀湿重与缓冲液A的比例为1g：10mL，洗涤完成后用缓冲液B悬起，均质机破碎3个循环，压力800bar，频率为50hHz，然后12000转/分离心10min，收集包涵体；
[0022]缓冲液A：50
±
20mM Tris
‑
HCl+1
±
0.1mmol/L EDTA+100
±
10mMNaCl，pH 8.0
±
0.1；
[0023]缓冲液B：50
±
20mM Tris
‑
HCl+1
±
0.1mmol/L EDTA+100
±
10mM NaCl+1
±
0.1％Triton X
‑
100，pH 8.0
±
0.1；
[0024]缓冲液C：50
±
20mM Tris
‑
HCl+1
±
0.1mmol/L EDTA+2.0
±
0.2mol/L urea+1
±
0.1％Triton X100+0.5
±
0.05mol/L NaCl,pH 8.0
±
0.1。
[0025]优选的，步骤(2)中洗涤具体为使用缓冲液C洗涤包涵体两次；用缓冲液D洗涤包涵体一次；
[0026]缓冲液C：50
±
20mM Tris
‑
HCl+1
±
0.1mmol/L EDTA+2.0
±
0.2mol/L urea+1
±
0.1％Triton X100+0.5
±
0.05mol本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人IL2包涵体纯化复性方法，其特征在于其步骤包括：(1)收集大肠杆菌表达的人IL2包涵体蛋白；(2)洗涤人IL2包涵体蛋白；(3)人IL2包涵体蛋白的两步溶解：用缓冲液E溶解包涵体蛋白，向溶解的包涵体蛋白中加入缓冲液F稀释包涵体蛋白，离心收集沉淀；用缓冲液G重新溶解包涵体蛋白；(4)人IL2包涵体蛋白柱上复性：用缓冲液H平衡Q柱，将步骤(3)获得的人IL2包涵体蛋白上样；缓冲液H洗杂；100％缓冲液I到100％缓冲液J的浓度梯度过柱复性，缓冲液K进一步柱上复性；100％缓冲液L到100％缓冲液M的浓度梯度线性洗脱；(5)将洗脱后的人IL2复性蛋白透析，超滤浓缩，得到成品；其中缓冲液E：50
±
20mmol/LTris+6
±
0.8mol/L盐酸胍+20
±
3mmol/L巯基乙醇+1.0
±
0.1mmol/L EDTA,pH 8.0
±
0.1；缓冲液F：50
±
20mmol/LTris+0.4
±
0.05M L
‑
Arginine Hydrochloride+2mM
±
0.2巯基乙醇+2.5
±
0.3mM GSH,0.8
±
0.1mM GSSG+1.0
±
0.1mmol/L EDTA,pH 8.0
±
0.1；缓冲液G：50
±
20mmol/LTris+8
±
1mol/L尿素+20
±
3mmol/L巯基乙醇+1.0
±
0.1mmol/L EDTA,pH 8.0
±
0.1；缓冲液H：50
±
20mmol/LTris+8
±
1mol/L尿素+20
±
3mmol/L巯基乙醇+1.0
±
0.1mmol/L EDTA,pH 8.0
±
0.1；缓冲液I：8
±
1mol/L尿素+50
±
20mM Tris+1.0
±
0.1mmol/L EDTA+0.1
±
0.01MNaCl，pH 8.0
±
0.1；缓冲液J：2
±
0.2mol/L尿素+50
±
20mM Tris+1.0
±
0.1mmol/L EDTA+0.1
±
0.01MNaCl，pH 8.0
±
0.1；缓冲液K：5mM
±
0.5β
‑
cyclodextrin+50
±
20mM Tris+1.0
±
0.1mmol/L EDTA+0.1
±
0.01M NaCl,pH 8.0
±
0.1；缓冲液L：50
±
20mM Tris+1.0
±
0.1mmol/L EDTA+0.1
±
0.01M NaCl,pH pH 8.0
±
0.1；缓冲液M：50
±
20mM Tris+1.0
±
0.1mmol/L EDTA+1
±
0.1M N...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昆鹏，易红飞，高宇，陈颖，陈金林，
申请(专利权)人：武汉翌圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：