BstDNA聚合酶活性的检测方法技术

本发明专利技术提供一种Bst DNA聚合酶活性的检测方法，以双链环状质粒DNA为模板，在dNTP mix和两对等温扩增引物的存在下，利用Bst DNA聚合酶进行等温扩增，制作Bst DNA聚合酶标准品与焦磷酸含量的标准曲线，通过检测待检样品扩增产物中的焦磷酸含量，根据标准曲线来计算出Bst DNA聚合酶的活性。利用Bst DNA聚合酶的活性在一定范围内与双链DNA产物的量呈正比，DNA产物的量与反应体系中的焦磷酸呈正比，因此其活性可以用焦磷酸试剂盒荧光强度来进行测定的特征，开发出本发明专利技术方法。本发明专利技术利用Bst DNA聚合酶的高聚合性和链置换活性，通过检测扩增产物的荧光信号来快速测定Bst DNA聚合酶的聚合活性，无放射性污染，具有简便、快速、高灵敏等优点。等优点。等优点。

【技术实现步骤摘要】
Bst DNA聚合酶活性的检测方法


[0001]本专利技术专利涉及一种Bst DNA聚合酶活性的检测方法。

技术介绍

[0002]Bst DNA聚合酶是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，来源于E.coli菌株。利用基因重组技术，在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离而得。该酶具有5'
→
3'DNA聚合酶活性，但不具有5'
→
3'外切核酸酶活性。Bst DNA聚合酶不能用于热循环测序或PCR，反应温度50
‑
70℃，最适温度65℃，但不能高于80℃，80℃灭活。
[0003]Bst DNA聚合酶有着较强的热稳定性、链置换活性及聚合酶活性，是等温扩增技术中的一个关键工具酶。环介导等温扩增(Loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种等温信号扩增方法，Bst DNA聚合酶以双链环状质粒DNA为模板，在等温条件和扩增引物的作用下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高。效率高是由于Bst DNA聚合酶具有较高的聚合酶和链置换活性，可以进行连续扩增产生大量相互衔接的双链DNA拷贝。DNA可在短时间内实现线性或指数扩增，具有较高的灵敏度。
[0004]Bst DNA聚合酶还可用于富含GC序列的DNA序列测定；亦可用于微量(纳克量)DNA模板的快速测序。在医学检测、病原微生物的检验检疫，食品检疫等各个领域有着重要的作用。
[0005]由于Bst DNA聚合酶应用领域较广泛，因此准确标定Bst DNA聚合酶的活性，保证各个批次间活性的稳定，具有重要的意义。传统的聚合酶活性测定方法通常采用同位素法，其原理主要是：依赖于放射性元素[3H]标记的核苷酸的掺入，即在Bst DNA聚合酶的反应体系和条件下，合成带有放射性标记的核苷酸链，通过测定酸不溶性产物中放射性同位素的量，计算出酶的活性。此种方法易产生放射性污染，并且需要进行沉淀、洗涤、干燥等多个步骤、周期长，难以实现高通量、自动化，给Bst DNA聚合酶的筛选带来了困难。

技术实现思路

[0006]本专利技术以环介导等温扩增技术为基础，建立了一种快速测定Bst DNA聚合酶活性的方法，不需要使用放射性同位素，具有简便、高灵敏度等优点。
[0007]本专利技术采用的技术方案为：
[0008]一种Bst DNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于以双链环状质粒DNA为模板，在dNTP mix和两对等温扩增引物的存在下，利用Bst DNA聚合酶进行等温扩增，制作Bst DNA聚合酶标准品与扩增产物中的焦磷酸含量的标准曲线，通过检测Bst DNA聚合酶待检样品扩增产物中的焦磷酸含量，根据标准曲线来计算出Bst DNA聚合酶的活性。
[0009]优选的，所述两对等温扩增引物序列如SEQ ID No.1
‑
4所示。
[0010](SEQ ID NO 1：5'
‑
TGCCCAGCTATCTGTCACTT
‑
3')；
[0011](SEQ ID NO 2：5'
‑
TCCCTTACGTCAGTGGAGAT
‑
3')；
[0012](SEQ ID NO 3：
[0013]5'
‑
AGGCATCTTCAACGATGGCCTTAAAGGAAGGTGGCTCCTACA
‑
3')；
[0014](SEQ ID NO 4：
[0015]5'
‑
TGCCGACAGTGGTCCCAAAGTTGAAGACGTGGTTGGAACG
‑
3')。
[0016]优选的，焦磷酸含量采用焦磷酸检测试剂盒，通过荧光法测得，焦磷酸的相对量以相对荧光强度表示。焦磷酸检测试剂盒可以采用PhosphoWorksTMFluorimetric Pyrophosphate Assay Kit*Blue Fluorescence*。
[0017]优选的，双链环状质粒DNA为pCAMBIA1300。
[0018]优选的，等温扩增的反应时间为30
‑
60min，温度为50
‑
70℃。
[0019]优选的，等温扩增完成后，先终止Bst DNA聚合酶的扩增反应，再检测扩增产物中的焦磷酸含量。
[0020]优选的，终止Bst DNA聚合酶的扩增反应的条件为反应体系升温到80℃，持续10
‑
20min。
[0021]利用Bst DNA聚合酶的活性在一定范围内与双链DNA产物的量呈正比，DNA产物的量与反应体系中的焦磷酸呈正比，因此其活性可以用焦磷酸试剂盒荧光强度来进行测定的特征，开发出本专利技术方法。本专利技术利用Bst DNA聚合酶的高聚合性和链置换活性，通过检测扩增产物的荧光信号来快速测定Bst DNA聚合酶的聚合活性，无放射性污染，具有简便、快速、高灵敏等优点。
附图说明
[0022]图1为本专利技术的酶活测定方法的原理图。
[0023]图2为本专利技术的测定方法获得的酶活
‑
荧光标准曲线图。
具体实施方式
[0024]下面依据图1展示的原理，结合实施例及对比例对本专利技术作进一步详细、完整地说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0025]实施例1、标准曲线的绘制
[0026](1)等温扩增反应所需要的试剂
[0027]表1：等温扩增反应试剂
[0028][0029][0030](2)等温扩增反应操作步骤
[0031]首先按照表2配制反应混合液(根据需要组分中除了Bst DNA聚合酶其余组分混匀配成mix分装)，将Bst DNA聚合酶酶液稀释至不同的梯度，分别加入等体积的Bst DNA聚合酶。混匀，离心后，将含有各个酶浓度梯度的反应混合液置于PCR仪上进行反应，55℃反45min，80℃失活10min，4℃hold；反应温度和时间可根据实际情况调整。
[0032]表2：等温扩增反应混合液参考体系
[0033]试剂名称体积(25μl)10
×
Isothermal amplification buffer2.5100mM MgSO40.75pCAMBIA1300210
×
primers2.5dNTP Mix(10mM each)3.5Bst DNA Polymerase2DEPC H2O11.75
[0034]标注：*10
×
primers:16μM FIP/16μM BIP/2μM F3/2μM B3
[0035](3)焦磷酸试剂盒荧光检测
[0036]反应结束后，分别取50μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Bst DNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于以双链环状质粒DNA为模板，在dNTP mix和两对等温扩增引物的存在下，利用Bst DNA聚合酶进行等温扩增，制作Bst DNA聚合酶标准品与扩增产物中的焦磷酸含量的标准曲线，通过检测Bst DNA聚合酶待检样品扩增产物中的焦磷酸含量，根据标准曲线来计算出Bst DNA聚合酶的活性。2.根据权利要求1所述的Bst DNA聚合酶活性的检测方法，其特征为：所述两对等温扩增引物序列如SEQ ID No.1
‑
4所示。3.根据权利要求1所述的Bst DNA聚合酶活性的检测方法，其特征为：焦磷酸含量采用焦磷酸检测试剂盒，通过荧光法测得，焦磷酸的相对量以相对荧光强度表示。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，赵文梦，刘想，
申请(专利权)人：武汉翌圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：