一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，属于检测技术领域，该检测方法基于果糖激酶FK活性，通过三步法酶动力学法测定的原理，该方法具体通过以下步骤，步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化；步骤二，酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量，实现对果糖的高特异性检测，检测范围较广，因此具有良好的应用前景。因此具有良好的应用前景。因此具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法


[0001]本专利技术涉及检测
，更具体地说，涉及一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法。

技术介绍

[0002]果糖是一种广泛存在于自然界中最为常见的己酮糖。果糖中含6个碳原子，也是一种单糖，是葡萄糖的同分异构体，是蔗糖的组成成份。
[0003]当人体摄入果糖后，通过肠道吸收后不依赖胰岛素直接进入细胞内代谢，是引起人体器官内脂肪沉积的重要因素之一。当饮食中果糖太多时，对肝脏、动脉和心脏都会有潜在危险。糖尿病人也存在血液循环中果糖水平的升高，果糖激酶失去功能突变引起的先天性果糖尿，患者在进食含果糖丰富是食物后，血中果糖含量升高，并从尿液中排出。
[0004]但是现有的果糖检测手段特异性不高，检测范围受限，因此提出一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法。

技术实现思路

[0005]1．要解决的技术问题针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，该检测方法基于果糖激酶FK活性，通过三步法酶动力学法测定的原理，第一步：通过FK以ATP作为辅助因子将果糖磷酸化为6
‑
磷酸果糖；第二步：反应过程中形成的ADP被丙酮酸激酶使用，将磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸；第三步：乳酸脱氢酶使用NADH作为辅因子将丙酮酸转化为乳酸，通过跟踪NADH在340nm处吸光度的降低来测量FK活性，实现对果糖检测的特异性高，检测范围较广。
[0006]2．技术方案为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。
[0007]本专利技术的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，该检测方法基于果糖激酶FK活性，通过三步法酶动力学法测定的原理，该方法具体通过以下步骤，步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化；步骤二，酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量，实现对果糖的高特异性检测。
[0008]进一步地，该检测方法中：步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化包含：S1、FK蛋白原核表达：S11、原核表达体系的构建：目的基因按照标准程序合成，使用大肠杆菌表达载体质粒pET
‑
28a，在酶切位点XhoⅠ/NcoⅠ处插入FK蛋白基因构建重组表达载体pET
‑
28a
‑
FK，卡那霉素（kan）抗性基因筛选，HIS标签蛋白纯化；S12、原核重组蛋白的表达与纯化；
步骤二酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法包含：S2、建立FK酶动力学检测方法：待评估化学物：D
‑
(
‑
)
‑
果糖、D
‑ꢀ
(+)
‑
葡萄糖、蔗糖；S22、检测设备：CLARIOstar 多功能酶标仪；S23、设置程序：反应混合物包括100 mM Tris
‑
HCl（pH 7.5），1 mM Fructose，1 mM ATP，100 mM KCl，1.5 mM MgCl2，1 mM PEP，0.5 mM NADH，0.2
ꢀµ
l PK / LDH，以及10 μl的纯化重组酶，最终反应容量为100
ꢀµ
l；S24、FK活性检测实验：首先选取两种不同浓度的FK对果糖进行检测，在体系中浓度范围为0至10 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度250 mM（反应体系中的终浓度为10 mM）开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照，在CLARIOstar多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始连续测定反应，并通过追踪340 nm处吸光度的变化来测定活性，这对应于NADH向NAD +的转化，该测定在25℃下进行30分钟，得到不同浓度果糖检测结果的对应数值输入Graphpad Prism 软件中进行分析，使用线性方程的回归线拟合进行分析，确定平均值
±
标准误差（n=4）；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量：S3、以血液、尿液和饮料的替代物作为果糖溶剂的实验前处理方法以及酶学检测。
[0009]进一步地，所述步骤S12中原核重组蛋白包括以下步骤：一、转化到表达菌：pET
‑
28a
‑
FK质粒加入BL21 （DE 3）感受态中混合，之后按照常规流程转化；二、批量诱导表达：挑选单菌落扩增批量表达，抗菌素为卡那霉素，使用IPTG诱导。
[0010]进一步地，用His
‑
tag Purification Resin的标准方法纯化，用SDS
‑
PAGE电泳检测蛋白纯度。
[0011]进一步地，所述步骤S3中血液的血清中果糖含量的检测包括以下步骤：一、样本预处理：为检测血液中果糖含量，使用FBS（胎牛血清）和血浆类似物（r
‑
SBFA）作为溶剂溶解不同浓度果糖，血浆类似物（r
‑
SBFA）取45μl加入1.5 ml EP管中，再加入5 μl不同浓度以血浆类似物（r
‑
SBFA）为溶剂的果糖，每个管中加入 150 μl 在4℃预冷过的甲醇溶液，涡旋混匀5min，
‑
20℃放置60分钟之后离心13000g（4℃，15min），取上清加入FK的反应体系，检测果糖浓度；二、标准曲线建立：预处理的样本上清中，果糖最高浓度设置为100 mM，稀释后反应体系中后终浓度为5 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照；三、样品检测：选取三个不同浓度的样品（n=3）对本实验方案的精确度进行检测。
[0012]进一步地，所述步骤S3中尿液中果糖含量的检测包括以下步骤：一、配制人工尿液(MP
‑
AU)：按下表中提供的顺序将相关试剂添加至100ml超纯水中；表1试剂Molarity(mM)Quantity(g/100ml)
Na2SO411.9650.17C5H4N4O31.4870.025Na3C6H5O7·
2H2O2.450.072C4H7N3O7.7910.0881CH4N2O249.751.5KCl30.9530.2308NaCl30.0530.1756CaCl2·
2H2O1.6630.0244NH4Cl23.6670.1266K2C2O40.190.0035MgSO44.3890.0449NaH2PO4·
2H2O18.6670.224Na2HPO4·
2H2O4.6670.1653二、标准曲线建立：称取适量果糖溶于人工尿液(MP
‑
AU)，果糖最高浓度设置为100 mM，稀释后反应体系中后终浓度为5 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照；三、样品检测：选取三个不同浓度的样品（n=3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征在于：该检测方法基于果糖激酶FK活性，通过三步法酶动力学法测定的原理，该方法具体通过以下步骤，步骤一，果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化；步骤二，酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量，实现对果糖的高特异性检测。2.根据权利要求1所述的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征在于：该检测方法中：步骤一、果糖激酶基因的质粒构建和果糖激酶蛋白的表达纯化包含：S1、FK蛋白原核表达：S11、原核表达体系的构建：目的基因按照标准程序合成，使用大肠杆菌表达载体质粒pET
‑
28a，在酶切位点XhoⅠ/NcoⅠ处插入FK蛋白基因构建重组表达载体pET
‑
28a
‑
FK，卡那霉素（kan）抗性基因筛选，HIS标签蛋白纯化；S12、原核重组蛋白的表达与纯化；步骤二、酶学检测：在FK酶动力学检测的基础上构建果糖检测方法包含：S2、建立FK酶动力学检测方法：待评估化学物：D
‑
(
‑
)
‑
果糖、D
‑ꢀ
(+)
‑
葡萄糖、蔗糖；S22、检测设备：CLARIOstar 多功能酶标仪；S23、设置程序：反应混合物包括100 mM Tris
‑
HCl（pH 7.5），1 mM Fructose，1 mM ATP，100 mM KCl，1.5 mM MgCl2，1 mM PEP，0.5 mM NADH，0.2
ꢀµ
l PK / LDH，以及10 μl的纯化重组酶，最终反应容量为100
ꢀµ
l；S24、FK活性检测实验：首先选取两种不同浓度的FK对果糖进行检测，在体系中果糖浓度范围为0至10 mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度250 mM（反应体系中的终浓度为10 mM）开始倍比稀释并设置果糖浓度为0 mM作为空白对照，在CLARIOstar 多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始连续测定反应，并通过追踪340 nm处吸光度的变化来测定活性，这对应于NADH向NAD +的转化，该测定在25℃下进行30分钟，得到不同浓度果糖检测结果的对应数值输入Graphpad Prism 软件中进行分析，使用线性方程的回归线拟合进行分析，确定平均值
±
标准误差（n=4）；步骤三，以血液、尿液和饮料的替代物作为实例检测标准品的果糖，进而检测样品的果糖含量：S3、以血液、尿液和饮料的替代物作为果糖溶剂的实验前处理方法以及酶学检测。3.根据权利要求2所述的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征在于：所述步骤S12中原核重组蛋白包括以下步骤：一、转化到表达菌：pET
‑
28a
‑
FK质粒加入BL21 （DE 3）感受态中混合，之后按照常规流程转化；二、批量诱导表达：挑选单菌落扩增批量表达，抗菌素为卡那霉素，使用IPTG诱导。4.根据权利要求2所述的一种基于果糖激酶反应体系的果糖检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李长红，朱秋莎，周雪，
申请(专利权)人：南京盛德瑞尔医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：