一种检测T7RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测T7RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA。本发明专利技术创造性提出一种检测T7RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法，利用T7RNA聚合酶进行转录反应，并通过检测反应生成焦磷酸的量计算待测T7RNA聚合酶的活性，检测过程操作简单、周期短且成本低，同时具备高灵敏度和准确性，对于实现T7RNA聚合酶活性的高通量、自动化检测具有重要意义。自动化检测具有重要意义。自动化检测具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]T7 RNA聚合酶是一类依赖于DNA的RNA聚合酶，并对T7噬菌体启动子有高度特异性。T7启动子是一段具有高度保守的20bp序列，该序列带有RNA转录起始位点。T7 RNA聚合酶对启动子的高度特异性不仅是T7噬菌体侵染的关键，对生物学家来说，还具有非常大的潜在应用价值，例如，T7 RNA聚合酶可以将插入到T7启动子后的DNA序列进行转录，产生大量特异的RNA序列，转录生成的RNA在杂交探针、体外翻译模板、包括RNA剪接和聚腺苷化的转录后修饰过程的研究、以及RNA结构、加工和催化研究等方面具有非常大的利用价值。
[0003]由于T7 RNA聚合酶应用领域较广泛，因此准确标定T7 RNA聚合酶的活性，保证各个批次间活性的稳定，具有重要的意义。传统的T7 RNA聚合酶活性测定方法通常采用同位素法，同位素法容易产生放射性污染，对检测设备要求高，操作成本高，难以实现高通量。
[0004]综上所述，如何开发一种简单、高效的T7 RNA聚合酶的活性检测方法，有助于实现高通量和自动化的活性检测，且具备高灵敏度和准确性，是T7 RNA聚合酶研究领域亟需解决问题之一。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒及检测方法，利用待测T7 RNA聚合酶以含有T7启动子的双链DNA为模板进行转录反应，发现在一定范围内T7 RNA聚合酶的活性与反应体系中焦磷酸的量呈正比，因此，可通过检测反应体系中焦磷酸的量检测T7 RNA聚合酶活性，方法简单、成本低，且具备高灵敏度和准确性，有利于广泛推广应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA。
[0008]本专利技术的试剂盒中包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA，将其与待测T7 RNA聚合酶混合后控制温度即可进行转录反应，双链DNA转录模板在T7 RNA聚合酶作用下，转录生成大量RNA链，并伴随着大量焦磷酸的产生，本专利技术发现在一定范围内T7 RNA聚合酶的活性与反应体系中焦磷酸的量呈正比，因此可通过T7 RNA聚合酶标准品建立T7 RNA聚合酶活性和焦磷酸的量的对应关系的标准曲线，进而通过检测待测T7 RNA聚合酶催化转录反应生成焦磷酸的量计算待测T7 RNA聚合酶的活性，检测原理示意图如图1所示。
[0009]优选地，所述核苷三磷酸包括三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷和三磷酸尿苷。
[0010]根据本专利技术，能够作为转录模板的含有T7启动子的双链DNA均能应用于本专利技术的
试剂盒。
[0011]优选地，所述含有T7启动子的双链DNA的长度为200～1500bp，包括但不限于201bp、202bp、203bp、204bp、210bp、220bp、250bp、300bp、400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1300bp、1400bp、1450bp、1480bp或1490bp。
[0012]优选地，所述含有T7启动子的双链DNA的核酸序列包括SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。
[0013]SEQ ID NO.1：
[0014]AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGC。
[0015]SEQ ID NO.2：
[0016]AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGCGATAAAATCATCCATCTGACCGATGATAGTTTTGATACCGATGTGCTGAAAGCAGATGGTGCAATTCTGGTGGATTTTTGGGCCGAATGGAAAGGCCCGGCCAAAATGATTGCCCCGATTCTGGATGAAATTGCCGATGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAATATTGATCAGAATCCGGGTACCGCCCCGAAATATGGCATTCGCGGCATTCCGACCCTGCTGCTGTTTCTGGCCAAACTGACCATTCCGGAAGTGGAACTGCCGAATGCCGAACTGCTGGGTAAACGTCGTCTGGAAAAATTTGCAGCAAAAGTTCAGCAGCAGCTGGAAAGTAGCGATCTGGATCAGTATCGCGCACTCGAACAAGTTTCAGTTGAAACCACTCAAGGCCTTGGCCGCCGTGTAACGATTACTATCGCTGCTGACAGCATCGAGACCGCTGTTAAAAGCGAGCTGGTCAACGTTGCGAAAAAAGTACGTATTGACGGCTTCCGCAAGGGCAAAGTGCCAATGAATATCGTTGCTCAGCGTTATGGCGCGTCTGTACGCCAGGACGTTCTGGGTGACCTGATGAGCCGTAACTTCATTGACGCCATCATTAAAGAAAAAATCAATCCGGCTGGCGCACCGACTTATGTTCCGGGCGAATACAAGCTGGGTGAAGACTTCACTTACTCTGTAGAGTTTGAAGTTTATCCGGAAGTTGAACTGCAAGGTCTGGAAGCGATCGAAGTTGAAAAACCGATCGTTGAAGTGACCGACGCTGACGTTGACGGCATGCTGGATACTCTGCGTAAACAGCAGGCGACCTGGAAAGAAAAAGACGGCGCTGTTGAAGCAGAAGACCGCGTGACCATCGACTTCACCGGTTCTGTAGACGGCGAAGAGTTCGAAGGCGGTAAAGCGTCTGA。
[0017]优选地，所述试剂盒还包括T7 RNA聚合酶标准品。
[0018]第二方面，本专利技术提供第一方面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA。2.根据权利要求1所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒，其特征在于，所述核苷三磷酸包括三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷和三磷酸尿苷；优选地，所述含有T7启动子的双链DNA的核酸序列包括SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列；优选地，所述试剂盒还包括T7 RNA聚合酶标准品。3.权利要求1或2所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒在检测T7 RNA聚合酶活性中的应用。4.一种T7 RNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述方法包括：将待测T7 RNA聚合酶与权利要求1或2所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒中的核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA混合，进行转录反应，检测反应产物中焦磷酸的含量，将所述焦磷酸的含量带入由T7 RNA聚合酶标准品建立的标准曲线中，得到所述待测T7 RNA聚合酶的活性。5.根据权利要求4所述的T7 RNA聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述标准曲线的建立方法包括：将T7 RNA聚合酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的T7 RNA聚合酶标准品，分别利用所述梯度酶活性的T7 RNA聚合酶标准品与权利要求1或2所述的检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒中的核苷三磷酸和含有T7启动子的双链DNA混合，进行转录反应，检测反应产物中焦磷酸的含量，获取每一个酶活性的T7 RNA聚合酶标准品对应的焦磷酸的含量，根据所述焦磷酸的含量与酶活性的对应关系建立所述标准曲线。6.根据权利要求4或5所述的T7 RNA聚合酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，阳瑜红，刘想，焦亮，
申请(专利权)人：武汉翌圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：