高效末端加A的突变型TaqDNA聚合酶及其编码DNA制造技术

本发明专利技术提供一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。本发明专利技术的Taq DNA聚合酶突变体，在加A效率上显著提高；能够耐受血液，腐殖酸，靛蓝这些常见的抑制剂；能直接进行PCR扩增，不需对DNA样本进行提取；显著缩短扩增时间，能更快获得STR检测结果。果。果。

【技术实现步骤摘要】
高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA


[0001]本专利技术专利涉及一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA，属于生物


技术介绍

[0002]STR（Short Tandem Repeat 短串联重复序列）是一种广泛存在于人类基因组中的分子遗传标记，是由2～6个碱基组成核心单位串联重复而形成的DNA序列。核心序列重复数目的变化，使其在群体中呈现多态性；同时在同一家系中又以孟德尔方式遗传，具有高度的遗传保守性；而且检测方法相对简单。因此该遗传标记物在法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等领域广泛应用。
[0003]Taq DNA聚合酶是第一个从水生嗜热杆菌中分离出来的耐热性DNA聚合酶。因为Taq DNA聚合酶具有极好的热稳定性，能够耐受PCR热变性过程，不需要每个循环额外添加新的聚合酶；因此该酶后面被广泛应用于各种PCR技术。它具有5'
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3'聚合活性，5'
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3'外切活性，无3'
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5'外切活性；同时具备在PCR产物3'末端加A的特性。STR常用的检测手段是PCR扩增之后跑毛细管电泳；毛细管电泳分辨率高可以区分1bp的产物。一般的Taq DNA聚合酶在跑毛细管电泳时会呈现一个碱基差异的分裂峰，一个加A一个不加A产物；这是由于Taq DNA聚合酶对于产物加A不完全导致的；这种有时候会影响对结果的判读。为了解决此问题，一般会在扩增结束之后增加60℃/72℃的延伸时间，确保产物的完全加A；但是这种方法会增加扩增时间。
[0004]STR作为法庭医学常用的检测手段之一，其常见的样本是血液或者血卡，为了缩短检测时间，会直接进行血液样本或者血卡的直扩而不对样本进行提取；这需要PCR所用的Taq DNA聚合酶拥有耐受血液的能力。另一方面从犯罪现场收集的DNA样本很多与泥土，沙石，腐烂树叶等混合在一起，提取的时候会有相对应抑制物的残留；抑制剂会阻碍目的片段的扩增导致扩增结果出现STR等位基因的丢失或者直接导致所有基因座扩增失败。因此这也要求用于STR的Taq DNA聚合酶具备一定的耐抑制能力。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，不但加A效率高，对血液和抑制剂的耐受能力也强。
[0006]本专利技术采用的技术方案为：一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。其中D188K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第188位的天冬氨酸突变为赖氨酸； T506R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第506位的苏氨酸突变为精氨酸；T710R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第710位的苏氨酸突变为精氨酸；A744K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第744位的丙氨酸突变为赖氨酸。
[0007]上述的高效末端加A的突变型TaqDNA聚合酶的编码DNA，其序列如SEQIDNO：2所示。
[0008]上述的高效末端加A的突变型TaqDNA聚合酶在STR检测中的应用。
[0009]本专利技术的TaqDNA聚合酶突变体，在加A效率上显著提高；能够耐受血液、腐殖酸、靛蓝这些常见的抑制剂；能直接进行PCR扩增，不需对DNA样本进行提取；显著缩短扩增时间，能更快获得STR检测结果。
附图说明
[0010]图1是本专利技术实施例1扩增产物的毛细管电泳结果。其中左边4个为野生型Taq酶的扩增结果，ATGC分别代表扩增引物5端碱基分别为ATGC；右边为本专利技术突变型Taq酶B
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Taq扩增5末端碱基为ATGC的引物的扩增结果。
[0011]图2是本专利技术实施例2扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。通道1
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5分别为血液百分比0，2.5%，5%，8%，10%的模板的扩增结果。
[0012]图3是本专利技术实施例2中，全血百分比为0%的1ng/ulgDNA的模板的扩增产物毛细管电泳的结果。
[0013]图4是本专利技术实施例2中，全血百分比为10%的血液模板的扩增产物毛细管电泳的结果。
[0014]图5是图5是本专利技术实施例3中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。通道1
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5分别是体系中加入0，5，10，15，20ng/ul腐殖酸的扩增结果。
[0015]图6是本专利技术实施例4中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。通道1
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5分别是体系中加入0，5，10，20，30mM靛蓝的扩增结果。
具体实施方式
[0016]实施例15'端ATGC加A测试合成引物序列如下基因座名称引物序列（5'
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3'）5T
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FTCACTCATTAGGCACCGGG5T
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RTCAACGACAGGAGCACGAT5A
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FACCAGACACCCATCAACAGT5A
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RATCGTTGGCAACCAGCATCG5C
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FCTCACTCATTAGGCACCGGG5C
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RCTCAACGACAGGAGCACGAT5G
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FGACCAGACACCCATCAACAGT5G
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RGATCGTTGGCAACCAGCATCG以PET28a载体质粒为模板，利用PCR对目的序列进行扩增，扩增分4个反应，分别以5A
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F5A
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R,5T
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F5T
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R,5G
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F5G
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R,5C
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F5C
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R4对引物进行扩增。同时对比本专利技术的突变型TaqDNA聚合酶（B
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Taq）与野生型Taq酶的加A情况。5'末端为G/C时，B
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Taq对比野生型Taq酶，无双峰情况，加A完全。说明该突变型Taq酶的加A效率优于野生型Taq酶。
[0017]表1：PCR检测体系示例
组分浓度25ul体系加入体积（μL）Tris
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HCl(pH8.8)1M1MgCl225mM2.0KCl2M2dNTPEach10μM0.5Primer
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F10μM0.5Primer
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R10μM0.5质粒模板1ng/μl1B
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Taq/Canaces5U/ul0.5ddH2O
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17表2：PCR循环过程示例将PCR反应产物跑毛细管电泳，示例性结果显示在图1。从图1可以看出：野生型Taq酶和突变型Taq酶B
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Taq在扩增5'末端为A，G的引物时，加A情况一致，但是扩增引物末端为T，C的引物时，野生型Taq酶的产物表现为明显的双峰，加A不完全；而突变型Taq酶的产物是单一峰，加A完全本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄淑云，
申请(专利权)人：武汉翌圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：