一种高性能多聚磷酸激酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5或SEQID NO:7，该突变体的酶活力比野生酶提高了至少4倍，能够用于构建催化生产谷胱甘肽的菌株。于构建催化生产谷胱甘肽的菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种高性能多聚磷酸激酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶催化和基因工程
，具体地说，涉及一种多聚磷酸激酶突变体及其在构建用于催化生产谷胱甘肽的菌株中的用途。

技术介绍

[0002]腺嘌呤核苷三磷酸(又称三磷酸腺苷，简称ATP)由1分子腺嘌呤、1分子核糖和3分子磷酸基团组成，是一种高能化合物，是生命代谢过程中重要的能量来源。在活细胞中，它与二磷酸腺苷(简称ADP)进行贮能和放能的相互转化，从而保证酶催化等生命活动的能量供应。在工业酶催化过程中，ATP参与很多重要的活性物质或药物的合成，但因ATP原料价格昂贵，极大限制了ATP耦联的酶促反应的商业化应用，因此酶促反应中ATP的循环再生是当前急需解决的问题。
[0003]目前，ATP的再生技术主要有以下三种：1)以葡萄糖为底物，利用酵母细胞糖酵解作用生成ATP。Jun Lin等人(Enzyme and Microbial Technology,44(5,6):269
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273)利用酿酒酵母ATP再生系统偶联大肠杆菌催化谷胱甘肽合成，谷胱甘肽产量达到7.82mM。该方法较早应用到工业化酶反应，但需向反应体系中加入大量的旺盛酵母活细胞，导致副产物较多，提高了工业化成本。2)无机磷化合物和ADP在光照条件下生成ATP。由于该方法需要光照参与反应，难以放大生产。3)磷酸转移酶催化高能磷酸化合物和ADP生成ATP。该方法具有工业化应用价值，是ATP再生系统领域的研究重点。
[0004]乙酸激酶和多聚磷酸激酶是ATP再生系统中常用的磷酸转移酶。乙酸激酶催化乙酰磷酸合成ATP，催化效率高，但是底物乙酰磷酸盐稳定性差，易分解，导致底物利用率低、副产物多、生产成本高。多聚磷酸激酶催化多聚偏磷酸合成ATP，底物价格低廉且稳定性好，易于工业化生产。2016年，李元等(生物工程学报,2016,12:1745
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1749)构建了共表达ATP再生和L
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茶氨酸合成酶的重组大肠杆菌菌株，并将其应用于L
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茶氨酸的合成中，产物的摩尔产率为86.0％。专利文献CN111850065A报导一种辅助全细胞转化合成L
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天冬酰胺的方法，利用III类多聚磷酸激酶2构建了单酶转化AMP再生ATP的系统，并将其应用于L
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天冬酰胺的生物合成，得率达到90.15％。但是多聚磷酸激酶的催化效率较低，且酶活受到底物抑制，因此难以进行工业化应用。专利文献CN111254129A报道了一种源于谷氨酸棒杆菌的多聚磷酸激酶及其突变体，可作为ATP再生剂可促进谷胱甘肽合成酶催化法生产谷胱甘肽，但该突变体的酶活力仍达不到进行工业化大规模生产谷胱甘肽的要求。因此需要进一步开发具有更高酶活力的多聚磷酸激酶，以便促进ATP再生系统相关产品的商业化应用。

技术实现思路

[0005]专利技术人对于多种微生物来源的多聚磷酸激酶进行了广泛的筛选，发现Luteovulum sphaeroides(球形卢帖菌)来源的多聚磷酸激酶lsPPK(NCBI登录号WP_011338472；SEQ ID NO:1)的酶活力较高，能够有效地作为ATP再生剂催化ADP转化为ATP，促进L
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谷胱甘肽的生物合成。为了寻找更高性能的多聚磷酸激酶，专利技术人进一步利用基因工程技术来对该多聚
磷酸激酶lsPPK进行改造和筛选，得到了几株多聚磷酸激酶突变体，能够以六聚偏磷酸钠作为底物，高效地催化高能磷酸键转移至ADP上，产生ATP，实现以多聚偏磷酸为底物的ATP再生系统的工业化应用、尤其是在生产谷胱甘肽中的应用。以此为基础，本专利技术包括如下技术方案。
[0006]一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7，其中，
[0007]SEQ ID NO:5为野生型多聚磷酸激酶(lsPPK)的氨基酸序列SEQ ID NO:1第13位的A替换为E、第77位的E替换为D、第328位的P替换为Q的突变体：
[0008]MAEDRAMPVMPPEADAAEAVPAAPTALPEEGPAGPEAPLQTLHGPRHFPAVDANAIRQAFEGGHYPYPRRLGRVVYDAEKARLQAELLKVQIWAQETGQKFVILMEGRDAAGKGGTIKRFMEHLNPRYARVVALTKPGERERGQWFFQRYIEHLPTAGEIVFFDRSWYNRAGVERVMGFCTPSEYLEFMRQAPELERMLVRSGIRLYKYWFSVTRDEQRARFLARETDPLKRWKLSPIDKASLDKWDDYTEAKEAMFFYIDTADAPWTIVKSNDKKRARLNCMRHFLSSLDYPGKDPEVVGVPDPLIVGRAAQVIGTAADILDSATPQALRKPRQG(SEQ ID NO:5)。
[0009]SEQ ID NO:7为多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:5第107位的G替换为V、第245位的K替换为T的突变体，即为野生型多聚磷酸激酶(lsPPK)的氨基酸序列SEQ ID NO:1第13位的A替换为E、第77位的E替换为D、第328位的P替换为Q、第107位的G替换为V、第245位的K替换为T的突变体：
[0010]MAEDRAMPVMPPEADAAEAVPAAPTALPEEGPAGPEAPLQTLHGPRHFPAVDAN AIRQAFEGGHYPYPRRLGRVVYDAEKARLQAELLKVQIWAQETGQKFVILMEVRDAAGKGGTIKRFMEHLNPRYARVVALTKPGERERGQWFFQRYIEHLPTAGEIVFFDRSWYNRAGVERVMGFCTPSEYLEFMRQAPELERMLVRSGIRLYKYWFSVTRDEQRARFLARETDPLKRWKLSPIDKASLDTWDDYTEAKEAMFFYIDTADAPWTIVKSNDKKRARLNCMRHFLSSLDYPGKDPEVVGVPDPLIVGRAAQVIGTAADILDSATPQALRKPRQG(SEQ ID NO:7)。
[0011]根据本专利技术的第二个方面，提供了编码上述多聚磷酸激酶突变体的基因。
[0012]优选地，当大肠杆菌作为宿主表达上述多聚磷酸激酶突变体时，编码多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:5的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，编码多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:7的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。
[0013]根据本专利技术的第三个方面，提供了包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。
[0014]根据本专利技术的第四个方面，提供了转化了上述质粒、用于表达上述多聚磷酸激酶突变体的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述多聚磷酸激酶突变体。
[0015]优选地，上述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7。2.编码如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:5的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，编码多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:7的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:7。4.表达如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的微生物。5.如权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。5
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1.如权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌BL21...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金刚，韦炎龙，梁岩，
申请(专利权)人：上海邦林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：