【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，具体地说，涉及一种扩环酶突变体及其在制备苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(g-7-adca)中的应用。
技术介绍
1、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-aminodesacetoxycephalosporanic acid，7-adca)是重要的头孢类抗菌素半合成中间体，在医药工业上用于合成头孢氨苄、头孢拉定和头孢羟氨苄等药物。
2、7-adca的合成方法包括化学合成法和生物合成法。化学合成法是以青霉素g(v)为起始原料制取7-adca，即青霉素钾盐经氧化、硅酯化扩环、裂解而得到7-adca，但是该工艺中使用大量有机试剂，难以达到当今的环保要求，且杂质含量多，生产成本高。利用生物合成法(酶法或微生物发酵法)全合成7-adca或替代化学合成步骤，具有环境友好和成本优势，但是主要核心技术掌握在国外公司手中，已报道的主要合成路线包括如下几种：
3、路线1是以青霉素n为底物扩环合成去乙酰氧基头孢菌素c(daoc)，随后经多步反应合成7-adca(proc natl acad sci usa 1978.75:6253–6257.)。专利文献cn1357051a公开了利用d-氨基酸-氧化酶(dao)将daoc转化为戊二酰-7-adca，利用戊二酰基转移酶(gla)将戊二酰-7-adca转化为7-adca。路线2是以异青霉素n为底物加入侧链形成侧链-6-apa，随后在扩环酶的作用下合成侧链-7-adca(产物)，最后在酰基转移酶的作用下合成7-adca。专利文献cn92112278.0公开了以己
4、青霉素g已有成熟的发酵生产工艺，价格较为低廉，是制备7-adca的理想底物。然而天然扩环酶活性较低，是以青霉素g为底物合成7-adca的限速步骤。因此，迫切需要提高扩环酶的催化活性。
技术实现思路
1、众所周知，氨基酸突变是提高酶活性的主要手段，酶活性中心和口袋区域的关键氨基酸位点改变有时会引起酶性质的明显改变。基于生物信息学分析的多种微生物来源的扩环酶数据比较筛选，专利技术人选定能够催化青霉素g扩环形成g-7-adca的棒状链霉菌(streptomyces clavuligerus)来源的扩环酶(wp_003952493.1)作为改造对象，尝试了对其进行突变，通过易错pcr法随机突变，结合突变体库高通量筛选，获得了一些酶活力显著提高的突变体。具体地，本专利技术提供了如下技术方案：
2、一种扩环酶突变体，其特征在于，为棒状链霉菌(streptomyces clavuligerus)来源的扩环酶(wp_003952493.1)的氨基酸序列seq id no:1中发生下述一个以上、优选两个以上、更优选三个以上、更优选四个以上位点突变所形成的突变体：s98、a129、l159、s261、f294，该扩环酶突变体催化青霉素g转化为苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(g-7-adca)的酶活力高于野生型扩环酶seq id no:1。
3、优选地，上述的突变选自s98g、a129s、l159m、s261t和f294i。
4、进一步地，上述扩环酶突变体的氨基酸序列优选为seq id no:3，是野生扩环酶(wp_003952493.1)的氨基酸序列seq id no:1中发生s98g、a129s、l159m、s261t和f294i突变所形成的突变体。
5、本专利技术第二个方面提供了一种dna分子，其包含编码上述扩环酶突变体的基因。
6、在一种实施方式中，编码上述氨基酸序列seq id no:3所示扩环酶突变体的基因的核苷酸序列为seq id no:4。
7、本专利技术第三个方面提供了一种重组质粒，其包含上述的dna分子。例如，该重组质粒上克隆了基因序列seq id no:4。
8、该重组质粒的质粒载体可以选自pmal系列、pgex系列、pet系列(例如pet22b、pet24a、pet28a)、pqe系列、pbad系列、pcal系列、psh系列、prsfduet系列或其他载体。
9、优选地，上述重组质粒的核苷酸序列可以为seq id no:5。
10、本专利技术的第四个方面提供了一种转化了上述重组质粒的微生物，即转入了上述重组质粒的转化子(转化体)，是表达上述扩环酶突变体的工程菌。
11、上述转化子的微生物宿主选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、需钠弧菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母。优选所述微生物宿主是大肠杆菌bl21(de3)。
12、本专利技术的第四个方面提供了上述扩环酶突变体或者上述微生物在生产苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(g-7-adca)中的用途。
13、具体地，以青霉素g为反应底物、上述扩环酶突变体或者上述微生物催化生产苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(g-7-adca)。
14、可选地，在反应体系中还可以添加有feso4、抗坏血酸和α-酮戊二酸。抗坏血酸(维生素c)通过氧化还原反应，将硫酸亚铁(feso4)的二价铁离子(fe2+)转变为三价铁离子(fe3+)。
15、该扩环转化反应可用下述反应式表示：
16、
17、该反应体系中，底物青霉素g的浓度为5mm以上，优选8mm以上，优选10mm以上，例如15mm以上。
18、在一种实施方式中，可以采用表达上述扩环酶突变体的上述微生物作为催化剂来催化底物进行扩环反应时，以微生物菌体形式或者其细胞破碎物形式添加于反应体系中。上述细胞破碎物例如是高压破碎菌体、细胞超声波破碎产物。
19、上述反应体系ph值为ph7.0-8.0，例如大约ph7.5。
20、上述反应体系的反应温度可以为20-40℃，例如22-35℃，优选25℃左右。
21、应理解，本文中在表述数值特征时，术语“大约”或者“左右”是指所表示的本数可以有±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的误差范围或浮动范围。
22、本专利技术筛选出酶活力显著提高的一些扩环酶突变体，其中氨基酸序列为seq idno:3的突变体的酶活力相比于野生型扩环酶(wp_003952493.1)提高了4倍，其催化青霉素g扩环反应合成g-7-adca时，底物青霉素g的浓度可达10mm以上，工业化应用潜力巨大。
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1.一种扩环酶突变体，其特征在于，为棒状链霉菌来源的扩环酶的氨基酸序列SEQ IDNO:1中发生下述一个以上位点突变所形成的突变体：S98、A129、L159、S261、F294，该扩环酶突变体催化青霉素G转化为苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的酶活力高于扩环酶SEQID NO:1。
2.如权利要求1所述的扩环酶突变体，其特征在于，所述突变选自S98G、A129S、L159M、S261T和F294I。
3.如权利要求2所述的扩环酶突变体，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO:3，是扩环酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生S98G、A129S、L159M、S261T和F294I突变所形成的突变体。
4.一种DNA分子，其包含编码如权利要求3所述扩环酶突变体的基因。
5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，编码氨基酸序列SEQ ID NO:3所示扩环酶突变体的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
6.一种重组质粒，其包含如权利要求4所述的DNA分子。该重组质粒的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:5。
7.转化了如权利要求6所述重组质粒的微生物。
8.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，微生物宿主选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、需钠弧菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母。优选所述微生物宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。
9.如权利要求1所述扩环酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，以青霉素G为反应底物、用权利要求3所述扩环酶突变体或者如权利要求7所述微生物催化生产苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)。
...【技术特征摘要】
1.一种扩环酶突变体，其特征在于，为棒状链霉菌来源的扩环酶的氨基酸序列seq idno:1中发生下述一个以上位点突变所形成的突变体：s98、a129、l159、s261、f294，该扩环酶突变体催化青霉素g转化为苯乙酰-7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的酶活力高于扩环酶seqid no:1。
2.如权利要求1所述的扩环酶突变体，其特征在于，所述突变选自s98g、a129s、l159m、s261t和f294i。
3.如权利要求2所述的扩环酶突变体，其特征在于，氨基酸序列为seq id no:3，是扩环酶氨基酸序列seq id no:1中发生s98g、a129s、l159m、s261t和f294i突变所形成的突变体。
4.一种dna分子，其包含编码如权利要求3所述扩环酶突变体的基因。
5.如权利要求4所述的dna分子，其特征在于，编码氨基酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：王金刚，韦炎龙，梁岩，任亮，
申请(专利权)人：上海邦林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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