一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法。所述检测体系包括：含5

【技术实现步骤摘要】
一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]甲基化修饰是表观遗传学调控的一种重要方式，且5
‑
甲基胞嘧啶(5mC)是DNA最常见的修饰碱基。双加氧酶，是使氧分子中的两个氧原子全部与底物相结合的氧化酶的总称。铁和α
‑
酮戊二酸依赖性双加氧酶[α
‑
oxoglutarate/Fe(II)
‑
dependentdioxygenases(α
‑
ODDs)]属于广泛分布于自然界中的非血红素铁蛋白，是一种参与多种氧化还原反应的重要酶类，其反应底物种类多样，可以是蛋白质，例如脯氨酰羟化酶(PHD)等；也可以是小分子化合物，例如核酸等。TET(ten
‑
eleventranslocation)酶是生物体内存在的一种Fe
2+
和α
‑
酮戊二酸依赖的双加氧酶，TET酶可通过一系列的氧化反应，可将5
‑
甲基胞嘧啶(5
‑
mC)转化为5
‑
羟甲基胞嘧啶(5
‑
hmC)，然后再转化为5
‑
甲酰胞嘧啶(5fC)和5
‑
羧基胞嘧啶(5caC)，而5caC能被DNA糖苷酶特异识别并切除，随后偶联碱基切除修复机制，实现DNA主动去甲基化。目前，TET酶广泛应用于甲基化测序试剂盒，如TET辅助的重亚硫酸盐测序，吡啶硼烷测序(TAPS)(TET
‑
assisted pyridineboranesequencing)、TAPSβ及CAPS，以及基因组甲基化测序(WGBS)等。
[0003]目前，TET酶活性测定方法包括酶联免疫吸附法、点杂交法和液相色谱
‑
串联质谱法等。多采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定TET酶活，如市面上的成品试剂盒，通过抗体显色法精准定量分析TET氧化5mC生成的5hmC的含量，但是无法分析后续氧化产物5caC的含量，因此无法准确测定TET酶活。通过点杂交技术，5mCDNA经过TET氧化后，可用5mC、5hmC、5fC和5caC抗体分别进行杂交，虽然可以检测多个样本，但是操作复杂、效率低下，成本高昂。另外，液相色谱
‑
串联质谱法，将TET氧化的5mCDNA回收经过核酸酶消解，通过LC
‑
MS分析底物及各个阶段氧化产物的占比，背景重，操作复杂，成本高昂。
[0004]综上所述，开发成本低，操作简单且可准确测定双加氧酶活的方法，对于双加氧酶应用领域具有重要意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法，本专利技术设计全新的检测方案，以期开发成本低，操作简单且可准确测定双加氧酶活的方法。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种双加氧酶的酶活检测体系，所述检测体系包括：含5
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甲基胞嘧啶和/或5
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羟甲基胞嘧啶的DNA片段、所述DNA片段的引物、用于将5
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甲酰胞嘧啶(5fC)和/或5
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羧基胞嘧啶(5caC)转化为非胞嘧啶的试剂、双加氧酶反应Buffer和DNA荧光定量试剂。
[0008]本专利技术中，设计全新的检测体系，以含5
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甲基胞嘧啶(5
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mC)和/或5
‑
羟甲基胞嘧啶
(5
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hmC)的DNA片段为底物，双加氧酶能够将5
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mC或5
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hmC氧化成5fC和5caC，随后利用转化试剂化学标记5fC和5caC，使其转变为非胞嘧啶，例如胸腺嘧啶(T)；然后以两端含G碱基的引物进行扩增反应，由于5fC和5caC已经转变为T，所以引物不能扩增体系中标记后的DNA，只能扩增未被氧化的初始底物DNA，最后用双链DNA(dsDNA)荧光定量试剂检测扩增产物荧光值，即酶投入量越多，则剩余的未被氧化的底物越少，扩增产物越少，荧光值越低，因此，其酶投入量与荧光值成反比，能够利用已知浓度的双加氧酶构建荧光值和浓度的标准曲线，实现双加氧酶的酶活检测。
[0009]可以理解，含5
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甲基胞嘧啶(5
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mC)和/或5
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羟甲基胞嘧啶(5
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hmC)的DNA片段，其中只要含5
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mC或5
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hmC即可，能够被双加氧酶氧化，其余部分具体序列可自由选择。
[0010]优选地，所述DNA片段的至少一端未被5
‑
甲基胞嘧啶和/或5
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羟甲基胞嘧啶甲基化修饰。
[0011]优选地，所述DNA片段的长度为200～600bp，包括但不限于201bp、202bp、205bp、206bp、210bp、255bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、560bp、570bp、580bp、590bp、590bp、598bp或599bp，进一步优选为454bp。
[0012]本专利技术中，控制所述DNA片段的长度，能够节约反应时间。
[0013]优选地，所述引物中含有14～17个C
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G碱基对。
[0014]优选地，所述引物的3
’
端末尾含有4～7个连续的C
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G碱基。
[0015]本专利技术中，基于引物的结合特异性(引物无法与被氧化及转化后的DNA片段结合)实现特异扩增，进一步发现，引物富含C
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G碱基对时，如3
’
端末尾含有4～7个连续的C
‑
G碱基，可最大限度阻滞引物结合转变为T的DNA序列。
[0016]可以理解，能够将5
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甲酰胞嘧啶和/或5
‑
羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂均适用于本专利技术，不作特殊限制。
[0017]可选地，所述用于将5
‑
甲酰胞嘧啶和/或5
‑
羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂包括硼烷吡啶络合物、2
‑
甲基吡啶硼烷、硼烷、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、1,3
‑
茚满二酮或丙二腈中的任意一种或至少两种的组合。在本专利技术的一些实施例中，用于将5
‑
甲酰胞嘧啶和/或5
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羧基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。
[0018]可以理解，所述双加氧酶反应Buffer指为双加氧酶反应提供环境的Buffer，可根据具体使用的双加氧酶自由选择，本申请不作特殊限制。
[0019]可选地，所述双加氧酶反应Buffer含有10～100mM缓冲体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：含5
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甲基胞嘧啶和/或5
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羟甲基胞嘧啶的DNA片段、所述DNA片段的引物、用于将5
‑
甲酰胞嘧啶和/或5
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羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂、双加氧酶反应Buffer和DNA荧光定量试剂。2.根据权利要求1所述的双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述DNA片段的长度为200
‑
600bp；优选为454bp；优选地，所述DNA片段的至少一端未被5
‑
甲基胞嘧啶和/或5
‑
羟甲基胞嘧啶甲基化修饰；优选地，所述引物中含有14～17个C
‑
G碱基对；优选地，所述引物的3
’
端末尾含有4～7个连续的C
‑
G碱基。3.根据权利要求1或2所述的双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述用于将5
‑
甲酰胞嘧啶和/或5
‑
羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂包括硼烷吡啶络合物、2
‑
甲基吡啶硼烷、硼烷、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、1,3
‑
茚满二酮或丙二腈中的任意一种或至少两种的组合。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述双加氧酶反应Buffer含有10～100mM缓冲体系、10～300mM氯化钠、0.1～10mMα
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酮戊二酸、0.1～10mML
‑
抗坏血酸、0.1
‑
10mM三磷酸腺苷和0.01～2mM二硫苏糖醇和0.1～50mM亚铁盐化合物。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的双加氧酶的酶活检测体系在制备双加氧酶的酶活检测产品中的应用。6.一种双加氧酶的酶活检测试剂盒，其特征在于，所述试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘想，刘雪，
申请(专利权)人：武汉翌圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：