脱氧核糖核酸酶I活性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种脱氧核糖核酸酶I活性检测方法，其步骤包括以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板，利用标准脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应，终止酶解反应，在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen，测定荧光值，绘制标准曲线；以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板，加入待测脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应，终止酶解反应，在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen，测定荧光值，根据上一步的标准曲线，计算待测脱氧核糖核酸酶I的酶活。本发明专利技术通过检测酶解产物的荧光信号来快速测定脱氧核糖核酸酶I的活性，无放射性污染，具有简便、快速、高灵敏等优点，可用于高通量、自动化的聚合酶活筛选。酶活筛选。酶活筛选。

【技术实现步骤摘要】
脱氧核糖核酸酶I活性检测方法


[0001]本申请涉及分子生物学领域，具体涉及一种脱氧核糖核酸酶I活性检测方法。

技术介绍

[0002]脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。脱氧核糖核酸酶I(DNase I)水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。
[0003]脱氧核糖核酸酶I(DNase I)活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，脱氧核糖核酸酶I(DNase I)可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，脱氧核糖核酸酶I(DNase I)可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1
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2个核苷酸突出的粘末端。脱氧核糖核酸酶I不耐高温，在37℃条件下即可进行酶解反应。
[0004]脱氧核糖核酸酶I是一种重要的分子生物学工具酶，可用于体外转录后去除模板DNA、RT
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PCR和RT
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qPCR之前制备无DNA的RNA、与DNA聚合酶I配合，通过缺口平移进行DNA标记、制备不含DNA的RNA、采用DNase I(无RNase)足迹法进行DNA
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蛋白相互作用研究等，在基因调控、分子诊断、细胞检测、生物医药等领域有着重要的作用。
[0005]由于脱氧核糖核酸酶I应用领域较广泛，因此准确标定脱氧核糖核酸酶I的活性，保证各个批次间活性的稳定，具有重要的意义。传统的脱氧核糖核酸酶I活性测定方法通常采用琼脂糖凝胶电泳法测定酶活，琼脂糖凝胶电泳法其原理主要是：产物经过凝胶电泳后再用放射性标记或染色，最后进行凝胶成像或观察降解效果来分析酶的活性。尽管这种方法已经被广泛使用，但其操作过程复杂，重复性差，只能给出半定量结果；并且染色剂有毒性或放射性，对操作者的健康不利。因此，建立脱氧核糖核酸酶I的快速、灵敏、准确的分析新方法具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种脱氧核糖核酸酶I活性检测方法，其步骤包括
[0007](1)采用标准脱氧核糖核酸酶I，以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板，利用脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应，终止酶解反应，在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen，测定荧光值，以酶用量为横轴，相对荧光值为纵轴，绘制标准曲线；
[0008](2)以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板，加入待测脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应，终止酶解反应，在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen，测定荧光值，根据步骤(1)获得的标准曲线，计算待测脱氧核糖核酸酶I的酶活。
[0009]优选的，所述环状双链DNA为pBR322。
[0010]优选的，酶解反应的时间为5
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20min，温度为25
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37℃。
[0011]优选的，终止酶解反应的条件为65
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75℃反应10
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20min。
[0012]Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料，其仅在与DNA双链结合后才发出荧
光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比，与酶量呈反比。本专利技术通过检测酶解产物的荧光信号来快速测定脱氧核糖核酸酶I的活性，无放射性污染，具有简便、快速、高灵敏等优点，可用于高通量、自动化的聚合酶活筛选。本专利技术方法与原始的半定量的方法比，更精确，操作简单。
附图说明
[0013]图1是本专利技术的原理示意图。
[0014]图2是DNase I酶活标准曲线。
[0015]图3是DNase I酶活标准曲线
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以双链环状质粒为模板。
[0016]图4是DNase I酶活标准曲线
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以小牛胸腺为模板。
具体实施方式
[0017]本专利技术的目的是建立一种无放毒性、简便、快速、高灵敏的脱氧核糖核酸酶I活性的测定方法。本专利技术原理如图1所示。
[0018]如图1所示，双链环状DNA或者双链线性DNA在脱氧核糖核酸酶I的存在下，被降解成单脱氧核苷酸或者双链的寡脱氧核苷酸，Picogreen染料不能结合这种产物，所以不能产生荧光；但是保持双链结构的DNA，其可以与Picogreen染料结合，产生荧光。
[0019]脱氧核糖核酸酶I在一定范围内与反应体系中双链DNA的量呈反比。其活性可以用Picogreen荧光强度来进行测定。
[0020]本专利技术的测定方法包括一下几个方面：
[0021]1.标准曲线的绘制
[0022](1)酶解反应所需要的试剂
[0023]表1：酶解反应试剂
[0024][0025](2)酶解反应操作步骤
[0026]表2：酶解反应混合液参考体系
[0027][0028]将DNase I酶液稀释至不同的梯度，具体的可以参照表3：
[0029]将各个酶浓度梯度的反应混合液置于PCR仪上进行反应，37℃反10min，75℃失活10min，4℃5min；反应时间可根据实际情况调整5min
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20min。
[0030](3)双链DNA定量试剂盒荧光检测
[0031]反应结束后，每管样品中加入1μl dsDNA定量试剂，涡旋混匀放置冰上，取100μl样品于黑色酶标板中，震荡混匀，室温孵育5min，设置波长(480nm，auto cutoff，520nm)后进行读数。
[0032](4)标准曲线的绘制
[0033]以酶用量(U/μl)为横轴，相对荧光值为纵轴，用OriginPro 8.6做非线性回归曲线绘制商品酶的标准曲线，如图2所示，发现这些数据点能够很好地拟合出一条曲线(R2>0.99)，证明此方法做出的酶活标准曲线可信度较高。根据待测样品的荧光值，软件即可自动计算出待测样品的酶活(U/μl)。
[0034]表3：DNase I不同酶浓度梯度及对应的荧光值
[0035][0036]2.DNase I活性的测定
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模板为环状质粒DNA
[0037](1)酶解反应所需要的试剂。用脱氧核糖核酸酶I(Takara 2270)制作标准曲线。
[0038]表4：酶解反应试剂
[0039][0040](2)酶解反应操作步骤
[0041]本实验待测样品测定与标准曲线实验同时进行，反应体系和操作流程相同，将本公司自产的DNase I样品进行酶活的测定。反应体系参照表5进行酶解反应。待测样品进行三次平行试验。
[0042]表5：酶解反应混合液参考体系
[0043][0044]反应条件：37℃孵育10min，75℃失活10min。
[0045]表6：DNase I(Takara)标准曲线荧光定量结果
[0046]序号酶浓度(U/μl)荧光值(FL)10.06251486.4320.1251437.7963本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脱氧核糖核酸酶I活性检测方法，其特征在于其步骤包括：(1)采用标准脱氧核糖核酸酶I，以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板，利用脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应，终止酶解反应，在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen，测定荧光值，以酶用量为横轴，相对荧光值为纵轴，绘制标准曲线；(2)以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板，加入待测脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应，终止酶解反应，在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen，测定荧光值，根据步骤(1)获得的标准曲线，计算...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，赵文梦，刘想，
申请(专利权)人：武汉翌圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：