一种提高线性多肽生物表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高线性多肽生物表达的方法，将EDDIE(C69E、C168E)

【技术实现步骤摘要】
一种提高线性多肽生物表达的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，涉及一种提高线性多肽生物表达的方法，具体涉及一种新型的融合表达标签，以及在促进异源多肽表达中的应用。

技术介绍

[0002]大肠杆菌表达系统具有较高的表达水平，较快的生长速度，适合连续和高细胞密度的培养方法，因此大肠杆菌是迄今为止生物技术中最受欢迎的重组蛋白生产宿主。然而，大肠杆菌表达系统仍存在一些不足，其中一个限制就是小蛋白和多肽的生产。由于通过直接表达方式来表达较小片段的多肽时，容易出现降解，导致产量低，同时也不适合表达对菌体生长不利的毒肽或抗菌肽。另外，许多重组多肽在表达过程中由于翻译速度过快同时缺少同源伴侣而容易在细菌中产生错误折叠。为了解决这一问题，许多标签被融合到目标蛋白中，其中一些通过形成包涵体蛋白，增加蛋白的产量。与可溶性表达相比，包涵体表达具有产量高、稳定性强、易于分离纯化等优势，而且减轻了目的蛋白或多肽对宿主细胞的毒性作用，但是包涵体蛋白需要通过复杂的复性过程才能得到正确折叠的功能蛋白，这在一定程度抵消了包涵体高表达优势。另外，对于生物医学应用来说，蛋白标签的去除是非常关键的。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种多肽表达的方法。
[0004]本专利技术还要解决的技术问题是提供一种制备多肽的方法。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题是提供一种EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供编码上述联合标签的基因。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供一种蛋白表达载体。
[0008]本专利技术还要解决的技术问题是提供一种试剂盒。
[0009]为了解决上述第一个技术问题，本专利技术公开了一种多肽表达的方法，包括以下步骤：将EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签与目标多肽融合表达所述目标多肽。
[0010]其中，所述EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0011]其中，本专利技术所述的EDDIE标签为包涵体标签蛋白标签；所述的EDDIE标签是Npro猪瘟自剪切蛋白的Npro突变蛋白，分别将其69位的Cys突变为Glu，168位的Cys突变为Glu。这主要是由于天然Npro蛋白纯化蛋白存在许多不足，与之相比，本专利技术所提供的Npro突变蛋白EDDIE可溶性增加，具有更快复性和更高剪切效率，但EDDIE在自剪切效率方面仍存在一定的不足；而在将EDDIE的剪切活性关键位点69位和168位突变后，使其不具有自剪切能力，但保留形成包涵体能力。
[0012]其中，所述目标多肽为抗菌肽、线性肽和毒肽中的任意一种。
[0013]为了解决上述第二个技术问题，本专利技术公开了一种制备多肽的方法，采用EDDIE(C69E、C168E)和Sumo这两种蛋白标签建立C端融合表达体系，同时用SUMO蛋白酶特异性的切割来去除标签，从而得到目的多肽，最后酶切产物通过固相萃取方法纯化。其中，本专利技术通过所建立的C端融合表达体系，将EDDIE的剪切活性关键位点69位和168位突变，使其不具有自剪切能力，但保留形成包涵体能力；利用SUMO蛋白标签还具有的促进蛋白的正确折叠的能力来使EDDIE复性过程中不容易沉淀。
[0014]具体地，所述方法包括以下步骤：将EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签与目标多肽融合表达，得到融合蛋白；将所述融合蛋白复性；采用与所述联合标签相适应的特异蛋白酶切除复性后融合蛋白中的Sumo标签，纯化，即得所述目标多肽。
[0015]其中，所述EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0016]其中，所述目标多肽为线性肽，包括但不限于抗菌肽、线性肽和毒肽中的任意一种。
[0017]其中，所述复性过程中采用的缓冲液为1
‑
1.5M Tris
‑
HCl，pH 7
‑
8，2.5
‑
10％甘油，1
‑
10mM三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐(Tcep盐酸盐)，优选为1M Tris
‑
HCl，pH 7.8，5％甘油，2mM Tcep盐酸盐。
[0018]其中，所述复性为透析复性。
[0019]其中，所述联合标签相适应的特异蛋白酶为SUMO蛋白酶，其效率较高。
[0020]其中，所述切除复性后融合蛋白中的Sumo标签方法为的剪切方法为：直接向浓度为0.8
‑
1.2mg复性融合蛋白/mL复性液复性融合蛋白中添加相应量的SUMO蛋白酶；所述SUMO蛋白酶的用量为待剪切的蛋白量
×
0.007
÷
Sumo蛋白酶浓度。
[0021]其中，所述酶切为在25
‑
35℃反应2.5
‑
4.5h，优选为30℃反应3.5h。
[0022]其中，所述纯化为采用C8反相柱纯化。
[0023]其中，所述C8反相柱的参数为碳含量：9％，比表面积：280m2/g粒径：40
‑
75μm平均孔径：
[0024]为了解决上述第三个技术问题，本专利技术公开了一种EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签，其包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0025]为了解决上述第四个技术问题，本专利技术公开了一种编码上述EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签的基因，其包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0026]为了解决上述第五个技术问题，本专利技术公开了一种蛋白表达载体，其包括上述EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签。
[0027]为了解决上述第五个技术问题，本专利技术公开了一种试剂盒，其包括上述EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签，或上述编码EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签的基因，或上述蛋白表达载体。
[0028]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：
[0029]本专利技术涉及一种线性多肽表达和纯化的方法，将多肽与包含体蛋白EDDIE(C69E、C168E)和SUMO蛋白标签融合，这种融合多肽可以在大肠杆菌中以包含体形式表达纯化，并在透析复性后利用SUMO蛋白酶将目的多肽切下，最后利用C8固相萃取反相柱纯化小肽，通过HPLC色谱分析纯度在80％
‑
90％；该方法可以有效解决包涵体难复性以及标签去除的问
题。
附图说明
[0030]下面结合附图和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：将EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签与目标多肽融合表达所述目标多肽；其中，所述EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。2.一种制备多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：将EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签与目标多肽融合表达，得到融合蛋白；将所述融合蛋白复性；采用与所述联合标签相适应的特异蛋白酶切除复性后融合蛋白中的Sumo标签，即得所述目标多肽；其中，所述EDDIE(C69E、C168E)
‑
Sumo联合标签包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述目标多肽为抗菌肽、线性肽和毒肽中的任意一种。4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述复性过程中采用的缓冲液为1
‑
1.5MTris
‑
HCl，pH 7
‑
8，2.5
‑
10％甘油，1
‑
10mM三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐。5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述联合标签相适应的特异蛋白酶为SUMO蛋白酶；所述切除复性后融合蛋白中的Sumo标签方法为的向...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗林，邹升，潘明娜，王芹芹，王新波，李义龙，刘文革，刘惠清，李向群，
申请(专利权)人：湖南中晟全肽生化有限公司，
类型：发明
国别省市：