用于增强非天然氨基酸掺入的嵌合热稳定氨酰tRNA合成酶制造技术

本发明专利技术描述了产生嵌合氨酰tRNA合成酶(aaRS)的方法，其中所述嵌合氨酰tRNA合成酶源自的细菌，其显示最佳活性和高热稳定性。这些嵌合aaRS可以更积极地进行工程化，以产生在生理温度下稳定的更广泛的Uaa选择性突变体。本发明专利技术进一步描述了由大肠杆菌和嗜热脂肪地芽孢杆菌TyrRS产生的嵌合TyrRS的组合物，其显示出相对于EcTyrRS增强的稳定性和相对于两种TyrRS酶的更高的活性。TyrRS酶的更高的活性。TyrRS酶的更高的活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增强非天然氨基酸掺入的嵌合热稳定氨酰tRNA合成酶
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求于2019年10月15日提交的美国临时申请第62/973,599号的权益，其通过引用整体纳入本文。
[0003]政府支持
[0004]目前的技术是使用美国国立卫生研究院(NIH)提供的基金开发的，资助号为：R01GM126220、R01GM124319和NIH/NIGMS R35 GM136437。因此，美国政府对本专利技术拥有某些权利。
[0005]序列表
[0006]本申请包含序列表，其以ASCII格式电子提交，并通过引用整体纳入本文。所述ASCII拷贝，创建于2020年10月15日，命名为0342_0009WO1_SL.txt，并且大小为87,778字节。


[0007]本专利技术涉及生物
，专注于开发用于表达位点特异性掺入非天然氨基酸的蛋白质的有效平台。

技术介绍

[0008]非天然氨基酸(Uaa)的位点特异性掺入对于探测和工程化哺乳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.包含嵌合热稳定氨酰tRNA合成酶的组合物，其中所述嵌合热稳定氨酰tRNA合成酶源自与其细菌热稳定氨酰tRNA合成酶同源物的核酸序列杂交的嗜温细菌氨酰tRNA合成酶的核酸序列。2.权利要求1所述的组合物，其中所述嗜温细菌氨酰tRNA合成酶是变体氨酰tRNA合成酶，其在其活性位点中包含突变，导致所述变体氨酰tRNA合成酶的底物特异性相对于野生型氨酰tRNA合成酶改变。3.权利要求1所述的组合物，其中所述热稳定细菌选自由以下各项组成的组：嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilis)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilis)或热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)物种。4.权利要求1所述的组合物，其中所述嗜温细菌选自由以下各项组成的组：大肠杆菌、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、链球菌属(Streptococcus)物种或假单胞菌属(Pseudomonas)物种。5.权利要求1所述的组合物，其中，所述热稳定细菌是嗜热脂肪地芽孢杆菌，并且所述嗜温细菌是大肠杆菌。6.权利要求1所述的组合物，其中所述嵌合热稳定氨酰tRNA合成酶相对于所述嗜温野生型氨酰tRNA合成酶具有增加的热稳定性。7.权利要求6所述的组合物，其中所述嵌合热稳定氨酰tRNA合成酶在高达约60℃下是可溶的。8.权利要求6所述的组合物，其中所述嵌合热稳定氨酰tRNA合成酶用天然存在的氨基酸氨酰化/负荷其同源野生型tRNA。9.权利要求1所述的组合物，其中所述嵌合氨酰tRNA合成酶相对于它们各自的野生型祖氨酰tRNA合成酶具有增加的生物活性，以便用非天然氨基酸氨酰化/负荷其同源野生型或变体tRNA。10.权利要求5所述的组合物，其中所述嵌合体包含热稳定细菌氨酰tRNA合成酶GSTyrRS和嗜温细菌氨酰tRNA合成酶EcTyrRS。11.权利要求10所述的组合物，其中所述嵌合体包含核酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:41，或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:41具有至少80％序列同一性的核酸序列。12.权利要求10所述的组合物，其中所述嵌合体包含核酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:45，或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:45具有至少80％序列同一性的核酸序列。13.权利要求2的组合物，其中所述活性位点中的突变导致哺乳动物蛋白质中的非天然氨基酸对苯甲酰基苯丙氨酸(pBpA)的掺入。14.权利要求13所述的组合物，其中所述嵌合体的氨基酸序列包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:47，或与SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:47具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。15.权利要求2的组合物，其中所述活性位点中的突变导致哺乳动物蛋白质中的非天然氨基酸O
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甲基酪氨酸(OMeY)的掺入。16.权利要求15的组合物，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:44，或与SEQ ID NO:44具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。17.细胞，其包含权利要求1至16中任一项的嵌合氨酰tRNA合成酶变体。
18.权利要求17所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。19.权利要求18所述的细胞，其中所述细胞选自由酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞组成的组。20.权利要求17所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。21.权利要求20所述的细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。22.权利要求21所述的细胞，其中所述大肠杆菌是工程化的ATM大肠杆菌菌株。23.生产嵌合热稳定氨酰tRNA合成酶的方法，包括：a)在嗜温微生物中鉴定目标氨酰tRNA合成酶；b)鉴定部分a)的氨酰tRNA合成酶的氨酰tRNA合成酶同源物，其中所述氨酰tRNA合成酶同源物源自嗜热微生物；c)构建嵌合体，所述嵌合体包含在部分a)和b)中鉴定的热稳定氨酰tRNA合成酶和氨酰tRNA合成酶的序列；和d)相对于部分a)和b)的它们各自的野生型祖氨酰tRNA合成酶，评估嵌合体的热稳定性和增加的氨酰化/负荷其同源tRNA的生物活性，从而产生嵌合热稳定氨酰tRNA合成酶。24.权利要求23所述的方法，其中所述部分a)的嗜温氨酰tRNA合成酶是变体氨酰tRNA合成酶，其在其活性位点中包含突变，导致所述变体氨酰tRNA合成酶的底物特异性相对于野生型氨酰tRNA合成酶改变。25.权利要求24所述的方法，其中所述变体氨酰tRNA合成酶的活性位点突变导致哺乳动物蛋白质中非天然氨基酸的掺入。26.在细胞中产生蛋白质的方法，所述蛋白质在该蛋白质的特定位置处具有一个或多个非天然氨基酸，所述方法包括，a.在适合生长的条件下在培养基中培养细胞，其中所述细胞包含具有一个...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿布舍克，
申请(专利权)人：波士顿学院董事会，
类型：发明
国别省市：