含有多个不同非天然氨基酸的蛋白质以及制备和使用此类蛋白质的方法技术

本发明专利技术总体上涉及产生包含第一非天然氨基酸(UAA)和第二不同的UAA的蛋白质的方法，以及包含第一UAA和第二不同的UAA的蛋白质。及包含第一UAA和第二不同的UAA的蛋白质。及包含第一UAA和第二不同的UAA的蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含有多个不同非天然氨基酸的蛋白质以及制备和使用此类蛋白质的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年10月8日提交的美国临时专利申请号62/912171的权益和优先权，该申请的全部内容以引用的方式并入本文以用于所有目的。
[0003]专利技术的领域
[0004]本公开一般涉及正交tRNA/氨酰基
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tRNA合成酶对用于将多个不同的UAA掺入正在被合成的目标蛋白质中的领域。

技术介绍

[0005]在自然界中，蛋白质是通过称为转录和翻译的过程在细胞中产生的。在转录过程中，包含一系列共同编码目标蛋白质的密码子的基因被转录成信使RNA(mRNA)。在翻译过程中，核糖体附着在mRNA上并沿其移动，并将特定氨基酸在与密码子对应的位置处掺入由mRNA合成(翻译)的多肽链中以产生蛋白质。在特定翻译过程中，与转运RNA(tRNA)偶联的天然氨基酸进入核糖体。含有反密码子序列的tRNAs与mRNA中它们各自的密码子序列杂交，并在合成蛋白质时将它们携带的氨基酸转移到新生蛋白质链的适当位置。r/>[0006]在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.生产包含第一非天然氨基酸(UAA)和第二不同的UAA的蛋白质的方法，所述方法包括在下述条件下与以下物质一起培养哺乳动物细胞：(i)包含编码第一tRNA的核苷酸序列的核酸，其中所述第一tRNA包含与选自UAG、UGA和UAA的第一密码子杂交并且能被装载第一UAA的反密码子；(ii)包含编码第一氨酰基
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tRNA合成酶的核苷酸序列的核酸，该第一氨酰基
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tRNA合成酶能够使所述第一tRNA装载第一UAA；(iii)包含编码第二tRNA的核苷酸序列的核酸，其中所述第二tRNA包含与选自UAG、UGA和UAA的第二密码子杂交并且能被装载第二UAA的反密码子，其中所述第一和所述第二tRNA不包含相同的反密码子；(iv)包含编码第二氨酰基
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tRNA合成酶的核苷酸序列的核酸，其中所述第二氨酰基
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tRNA合成酶能够使所述第二tRNA装载第二UAA；和(v)核酸，其包含含有第一密码子和第二密码子的编码所述蛋白质的核苷酸序列；其中所述条件为允许所述第一tRNA当在细胞中表达并装载所述第一UAA时与所述第一密码子杂交并指导所述第一UAA掺入所述蛋白质中，以及允许所述第二tRNA当在细胞中表达并装载所述第二UAA时与所述第二密码子杂交并指导所述第二UAA掺入蛋白质中；其中由所述细胞表达的包含第一和第二UAA的所述蛋白质的量是由相同细胞或类似细胞表达的参考蛋白的量的至少10％，其中所述参考蛋白是不包含第一和第二UAA而在其他方面相同的蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一tRNA是原核色氨酰
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tRNA的类似物或衍生物。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述原核色氨酰
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tRNA是大肠杆菌色氨酰
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tRNA。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一tRNA包含选自SEQ ID NO：49
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54或108
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113中任一个的核苷酸序列。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中，所述第一氨酰基
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tRNA合成酶是原核色氨酰
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tRNA合成酶的类似物或衍生物。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述原核色氨酰
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tRNA合成酶是大肠杆菌色氨酰
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tRNA合成酶。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一氨酰基
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tRNA合成酶包含选自SEQ ID NO：44
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48中任一个的氨基酸序列。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中，所述第一密码子是UGA。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中，所述第一UAA是色氨酸类似物。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一UAA选自5
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HTP和5
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AzW。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中，所述第二tRNA是原核亮氨酰
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tRNA的类似物或衍生物。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述原核亮氨酰
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tRNA是大肠杆菌亮氨酰
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tRNA。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二tRNA包含选自SEQ ID NO：16
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43中任一个的核苷酸序列。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中，所述第二氨酰基
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tRNA合成酶是原核亮氨酰
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tRNA合成酶的类似物或衍生物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述原核亮氨酰
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tRNA合成酶是大肠杆菌亮氨酰
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tRNA合成酶。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二氨酰基
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tRNA合成酶包含选自SEQ ID NO：1
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15中任一个的氨基酸序列。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中所述第二密码子是UAG。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中所述第二UAA是亮氨酸类似物。19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第二UAA选自LCA和Cys
‑5‑
N3。20.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中，所述第二tRNA是原核酪氨酰
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tRNA的类似物或衍生物。21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述原核酪氨酰
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tRNA是大肠杆菌酪氨酰
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tRNA。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二tRNA包含选自SEQ ID NO：68
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69或104
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105中任一个的核苷酸序列。23.根据权利要求20
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22中任一项所述的方法，其中所述第二氨酰基
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tRNA合成酶是原核酪氨酰
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tRNA合成酶的类似物或衍生物。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述原核酪氨酰
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tRNA合成酶是大肠杆菌酪氨酰
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tRNA合成酶。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第二氨酰基
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tRNA合成酶包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列。26.根据权利要求20
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25中任一项所述的方法，其中所述第二密码子是UAG。27.根据权利要求20
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26中任一项所述的方法，其中所述第二UAA是酪氨酸类似物。28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述第二UAA选自OmeY、AzF和OpropY。29.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中，所述第二tRNA是古生菌吡咯赖氨酰
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tRNA的类似物或衍生物。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述古生菌吡咯赖氨酰
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tRNA是巴氏甲烷八叠球菌(M.barkeri)吡咯赖氨酰
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tRNA。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二tRNA包含选自SEQ ID NO：72
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100或106
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107中任一个的核苷酸序列。32.根据权利要求29
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31中任一项所述的方法，其中所述第二氨酰基
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tRNA合成酶是古生菌吡咯赖氨酰
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tRNA合成酶的类似物或衍生物。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述古生菌吡咯赖氨酰
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tRNA合成酶是巴氏甲烷八叠球菌吡咯赖氨酰
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tRNA合成酶。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第二氨酰基
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tRNA合成酶包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列。35.根据权利要求29
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34中任一项所述的方法，其中所述第二密码子是UAG。36.根据权利要求29
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35中任一项所述的方法，其中所述第二UAA是吡咯赖氨酸类似物。37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述第二UAA选自BocK、CpK和AzK。38.根据权利要求1
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37中任一项所述的方法，其中由所述细胞表达的包含所述第一和第二UAA的蛋白质的量为由相同细胞或相似细胞表达的参考蛋白的量的至少20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、或90％。39.根据权利要求1
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38中任一项所述的方法，其中，所述参考蛋白在对应于所述第一和第二UAA的位置处包含野生型氨基酸残基。40.根据权利要求1
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39中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是抗体(或其片段，例如其抗原结合片段)、双特异性抗体、纳米抗体、亲和体、病毒蛋白、趋化因子、细胞因子、抗原、凝血因子、激素、生长因子、酶、细胞信号传导蛋白或任何其他多肽或蛋白质。41.根据权利要求40所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑羽楠，詹姆斯，
申请(专利权)人：波士顿学院董事会，
类型：发明
国别省市：