吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体及其筛选系统和应用技术方案

为解决现有技术中无法在特定位点特异性引入带有乳酰化基团的蛋白的问题，本发明专利技术提供一种吡咯赖氨酸氨酰

【技术实现步骤摘要】
吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶突变体及其筛选系统和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，本专利技术涉及吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶突变体及其筛选系统和应用。

技术介绍

[0002]组蛋白存在于真核细胞中，是将DNA包装到核小体中的蛋白质。组蛋白翻译后修饰(HPTM)是一类调控基因表达的翻译后修饰，参与许多重要的生命过程，如DNA的复制和修复、RNA的转录等。不同类型的HPTM可以单独或组合起来以调节与染色质相关的各种活性。HPTM识别事件的失调会导致许多疾病的发生，例如癌症。近些年来，质谱学的方法技术在蛋白质组学中的应用日渐深入，学者们亦相继鉴定出了多种新型组蛋白赖氨酸酰化反应，例如丙酰化，丁酰化，丙二酰化，戊二酰化，β
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羟基丁酰化，2
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羟基异丁酰化，琥珀酰化，巴豆酰化，以及乳酰化等。研究表明，这些修饰参与调节染色质重塑，基因表达，细胞周期和细胞代谢等多种生命活动。最近的研究表明，HPTM与癌症，代谢性疾病，神经精神疾病，不育症，肾脏疾病及后天免本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶突变体，其特征在于，所述吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶突变体为SEQ ID NO.10所示吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶的氨基酸序列中301位、306位、309位、348位的氨基酸残基突变得到，所述突变为：301位替换为缬氨酸(V)，306位替换为亮氨酸(L)，309位替换为丙氨酸(A)，348位替换为苯丙氨酸(F)(SEQ ID NO.7)；或，301位替换为蛋氨酸(M)，306位替换为亮氨酸(L)，309位替换为丙氨酸(A)，348位替换为苯丙氨酸(F)(SEQ ID NO.8)；或，301位替换为异亮氨酸(I)，306位替换为亮氨酸(L)，309位替换为丙氨酸(A)，348位替换为苯丙氨酸(F)(SEQ ID NO.9)。2.一种筛选权利要求1所述吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：构建包括吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶饱和突变库的质粒：所述吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶饱和突变库为将如GenBank Sequence ID:WP_011033391.1所示野生型吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶的氨基酸序列突变得到，突变位点包括301位、306位、309位、以及348位的氨基酸残基；将编码吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶饱和突变库的核苷酸序列连入基础质粒，获得所述包括吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶饱和突变库的质粒；优选的，所述重组载体包含GlnRS启动子、编码吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶饱和突变库的核苷酸序列、GlnRS终止子、ColE1复制原点、硫酸卡那霉素抗性基因；S2：构建筛选质粒：将SEQ ID NO.2所示包括氯霉素抗性报告基因的核苷酸片段、SEQ ID NO.3所示包括绿色荧光蛋白报告基因的核苷酸片段、SEQ ID NO.4所示包括T7RNA聚合酶基因的核苷酸片段通过同源重组连接起来，得到重组质粒，所述重组质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；SEQ ID NO.11所示重组质粒的1
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219bp和9544
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9984bp的底部链编码氯霉素抗性基因，经过双点突变，将SEQ ID NO.11所示重组质粒的9868bp～9873bp的ctagtc突变位atccta，使重组质粒中的氯霉素抗性基因编码的氨基酸序列的112号位点突变为112D，111位点突变成为琥珀终止密码子TAG，得到所述筛选质粒；S3：将S2得到的筛选质粒转入大肠杆菌感受态细胞，得到含有筛选质粒的感受态细胞；将S1构建的包括吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶饱和突变库的质粒转化至含有筛选质粒的感受态细胞，分别接种至添加非天然氨基酸的液体培养基和不添加非天然氨基酸的液体培养基中进行筛选，如果突变样品同时满足：(1)在添加非天然氨基酸的液体培养基上具有氯霉素抗性、能够观察到荧光；(2)在不添加非天然氨基酸的液体培养基上不具有氯霉素抗性、不能够观察到荧光；则筛选得到权利要求1所述吡咯赖氨酸氨酰
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tRNA合成酶突变体。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2所述筛选质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，SEQ ID NO.3所示包括绿色荧光蛋白报告基因的核苷酸片段，为采用pSel
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sfGFP引物对从SEQ ID NO.5所述质粒pET
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28a
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sfGFP中扩增得到，SEQ ID NO.4所示包括T7RNA聚合酶基因的核苷酸片段，为采用pSel
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RNAP引物对从SEQ ID NO.6所述质粒pBad
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T7RNAP
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TAG中扩增得到。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pSel
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sfGFP引物对为：
pSel
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sfGFP
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F：5'
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【专利技术属性】
技术研发人员：王南溪，李欢欢，唐槊，程剑，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：