一种人源ATP合成酶的纯化方法技术

本发明专利技术属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种人源ATP合成酶的纯化方法。本发明专利技术提供了一种人源ATP合成酶的纯化方法，制备人源线粒体粗提物，溶膜，得线粒体总蛋白溶液；通过阳离子交换柱、阴离子交换柱及凝胶排阻色谱柱的手段分离纯化人源ATP合成酶。本发明专利技术提供的纯化方法具有操作方法简单，实验成本低，时长短的特点，得到的人源ATP合成酶蛋白纯度高，生理活性好，可用于后续的结构功能及药物发现研究。可用于后续的结构功能及药物发现研究。可用于后续的结构功能及药物发现研究。

【技术实现步骤摘要】
一种人源ATP合成酶的纯化方法


[0001]本专利技术属于蛋白纯化
，具体涉及一种人源ATP合成酶的纯化方法。

技术介绍

[0002]ATP合成酶是生物体合成能量货币ATP的蛋白复合物，是氧化磷酸化系统最后也是最重要的一员，能够将电子传递链复合物形成的质子梯度转化为化学能储存在ATP中。由于ATP合成酶在生物体正常功能发挥中的重要作用，ATP合成酶异常往往与疾病密切相关，比如神经退行性疾病、肿瘤等。ATP合成酶许多位点的突变会导致不同的癌症或其他疾病。此外，鉴于肿瘤细胞增殖对于氧化磷酸化通路能量供给的需求，越来越多的靶向ATP合成酶的新型抗肿瘤药物被开发出来，并表现出了良好的抗肿瘤活性。
[0003]近年来，哺乳动物ATP合成酶的结构和功能研究有了重大进展，但是至今无人纯化出纯度高、有活性的人源ATP合成酶并解析结构，当前用于研究线粒体蛋白主流的密度梯度离心的方法对设备要求较高，超速离心机价格昂贵，通常需要离心24h，离心时间长，并且纯度不高，使我们对人源ATP合成酶的结构功能机制的了解仍有限，由此制约了针对该靶点的新药开发。研究人源ATP合成酶的结构与功能，对于深入了解人体细胞ATP的合成机制、突变致病机制及药物发现等都具有的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种人源ATP合成酶的纯化方法，获得高纯度人源ATP合成酶，降低生产成本。
[0005]本专利技术提供了一种人源ATP合成酶的纯化方法，包括如下步骤：
[0006]制备人源线粒体粗提物，溶膜，得线粒体总蛋白溶液；
[0007]利用阳离子交换柱对所述线粒体总蛋白溶液进行第一洗脱，收集洗脱液，得第一纯化液；
[0008]利用阴离子交换柱对所述第一纯化液进行第二洗脱，收集洗脱液，得第二纯化液；
[0009]利用凝胶排阻色谱柱对所述第二纯化液进行第三洗脱，得纯化的人源ATP合成酶。
[0010]优选的，所述溶膜的时间为30min～120min。
[0011]优选的，所述溶膜的方式包括加入去污剂；所述去污剂包括LMNG、Digitonin和GDN中的一种或多种。
[0012]优选的，利用缓冲液C和缓冲液D进行所述第一洗脱；
[0013]所述缓冲液C包括20mM 2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸和0.004％W/V去污剂；所述缓冲液C的pH为6.0；
[0014]所述缓冲液D包括20mM 2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸、1M NaCl和0.004％W/V去污剂；所述缓冲液D的pH为6.0。
[0015]优选的，所述第一洗脱的流速为1mL/min；所述第一洗脱的方式为梯度洗脱；
[0016]所述梯度洗脱的程序为：
[0017]0min：所述缓冲液C的体积百分含量为95％；所述缓冲液D的体积百分含量为5％；
[0018]0～40min：所述缓冲液C的体积百分含量由95％匀速减少到75％；所述缓冲液D的体积百分含量由5％匀速增加到25％；
[0019]优选的，依次利用缓冲液F和缓冲液G进行所述第二洗脱；
[0020]所述缓冲液F包括20mM MOPS和0.004％W/V去污剂；所述缓冲液F的pH为7.4；
[0021]所述缓冲液G包括20mM MOPS、1M NaCl和0.004％W/V去污剂；所述缓冲液D的pH为7.4。
[0022]优选的，所述第二洗脱的流速为1mL/min；所述第二洗脱的方式为梯度洗脱；
[0023]所述梯度洗脱的程序为：
[0024]0min：所述缓冲液F的体积百分含量为95％；所述缓冲液G的体积百分含量为5％；
[0025]0～20min：所述缓冲液F的体积百分含量由95％匀速减少到75％；所述缓冲液G的体积百分含量由5％匀速增加到25％；
[0026]优选的，所述去污剂包括LMNG、Digitonin和GDN中的一种或多种。
[0027]优选的，进行第三洗脱前，还包括：利用100KDa截留分子量的浓缩管对所述第二纯化液进行浓缩。
[0028]优选的，所述人源线粒体粗提物的制备方法包括：破碎人源细胞，分离得所述人源线粒体粗提物。
[0029]本专利技术提供了一种人源ATP合成酶的纯化方法，制备人源线粒体粗提物，溶膜，得线粒体总蛋白溶液；依次通过阳离子交换柱、阴离子交换柱及凝胶排阻色谱柱的手段分离纯化人源ATP合成酶。本专利技术提供的纯化方法具有操作方法简单，实验成本低，时长短的特点，得到的人源ATP合成酶蛋白纯度高，生理活性好，可用于后续的结构功能及药物发现研究。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0031]图1为SP阳离子交换柱图洗脱结果，横坐标为色谱柱洗脱体积，单位为mL；左纵坐标为280nm紫外吸收，单位为mAU；右纵坐标为电导，单位为mS/cm；
[0032]图2为SP阳离子交换柱取样BN
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PAGE电泳结果；
[0033]图3为Q阴离子交换柱洗脱结果，横坐标为色谱柱洗脱体积，单位为mL；左纵坐标为280nm紫外吸收，单位为mAU；右纵坐标为电导，单位为mS/cm；
[0034]图4为Q阳离子交换柱取样BN
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PAGE电泳结果；
[0035]图5为凝胶排阻色谱柱图洗脱结果，图中横坐标为色谱柱洗脱体积，单位为mL；纵坐标为280nm紫外吸收，单位为mAU；
[0036]图6为样品SDS
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PAGE图，左为marker，样品组分经过胶条质谱鉴定；
[0037]图7为ATP水解活性测试。
具体实施方式
[0038]本专利技术提供了一种人源ATP合成酶的纯化方法，包括如下步骤：
[0039]制备人源线粒体粗提物，溶膜，得线粒体总蛋白溶液；
[0040]利用阳离子交换柱对所述线粒体总蛋白溶液进行第一洗脱，收集洗脱液，得第一纯化液；
[0041]利用阴离子交换柱对所述第一纯化液进行第二洗脱，收集洗脱液，得第二纯化液；
[0042]利用凝胶排阻色谱柱对所述第二纯化液进行第三洗脱，得纯化的人源ATP合成酶。
[0043]本专利技术对所述人源线粒体粗提物的来源并没有特殊限定，优选从人源细胞中提取得到，更优选包括：破碎人源细胞，分离得所述人源线粒体粗提物。本专利技术所述人源细胞优选为293F细胞；所述破碎的方式优选包括：将人源细胞与缓冲液A混合研磨。本专利技术优选使用玻璃组织匀浆器进行研磨。本专利技术所述缓冲液A优选包括250mM sucrose，20mM 3
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(N
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morpholino)propanesulfonic acid(MOPS)和1mM ethyleneglycoltetraacetic acid(EG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源ATP合成酶的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：制备人源线粒体粗提物，溶膜，得线粒体总蛋白溶液；利用阳离子交换柱对所述线粒体总蛋白溶液进行第一洗脱，收集洗脱液，得第一纯化液；利用阴离子交换柱对所述第一纯化液进行第二洗脱，收集洗脱液，得第二纯化液；利用凝胶排阻色谱柱对所述第二纯化液进行第三洗脱，得纯化的人源ATP合成酶。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述溶膜的时间为30min～120min。3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述溶膜的方式包括加入去污剂；所述去污剂包括LMNG、Digitonin和GDN中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的纯化方法，利用缓冲液C和缓冲液D进行所述第一洗脱；所述缓冲液C包括20mM 2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸和0.004％W/V去污剂；所述缓冲液C的pH为6.0；所述缓冲液D包括20mM 2
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吗啡啉)乙磺酸、1M NaCl和0.004％W/V去污剂；所述缓冲液D的pH为6.0。5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述第一洗脱的流速为1mL/min；所述第一洗脱的方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min：所述缓冲液C的体积百分含量为95％；...

【专利技术属性】
技术研发人员：贡红日，饶子和，赖越峥，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：