大麻二酚酸合成酶突变体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了大麻二酚酸合成酶突变体及其构建方法与应用，属于合成生物领域基因工程改造技术领域。与野生型的CBDAS相比，应用本发明专利技术所提供的CBDAS点突变体生产CBDA时，CBDA的产量均有不同幅度的提高，其中，C446A突变体所对应的CBDA产量提高了91.3%，达123 mg/L。mg/L。mg/L。

【技术实现步骤摘要】
大麻二酚酸合成酶突变体及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及大麻二酚酸合成酶突变体及其构建方法与应用，属于合成生物领域基因工程改造


技术介绍

[0002]CBDA化学名称为2,4
‑
dihydroxy
‑3‑
[(1R,6R)
‑3‑
methyl
‑6‑
prop
‑1‑
en
‑2‑
ylcyclohex
‑2‑
en
‑1‑
yl]‑6‑
pentylbenzoic acid，分子式为C
22
H
30
O4，CAS号为1244
‑
58
‑
2。
[0003]大麻二酚(Cannabidiol, CBD)是大麻植物的次生代谢物，是由CBDA经脱羧获得。研究发现CBD具有抗肿瘤、神经保护、代谢和免疫调节、抗炎抗氧化、保护心血管和护肝等功效，2008年FAD批准了首个工业大麻植物来源的CBD处方药Epidiolex，用于治疗两种非常严重且罕见的婴儿癫痫病Dravet综合征和Lennox
‑
Gastut综合症。在传统的工业生产中，CBD主要是通过提取大麻植物的前体CBDA，然后经过加热脱羧后得到CBD。该方法存在周期长、效率低、成本高、环境不友好和可能含有致幻成分四氢大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）等缺点。因此，采用合成生物学技术实现以廉价原材料在短周期内高效合成CBDA十分必要。
[0004]CBDA在大麻（Cannabissativa）植物里由CBDAS（Cannabidiolic acid synthase，大麻二酚酸合成酶）以FAD为辅因子，通过对底物大麻萜酚酸 (Cannabinol acid，CBGA)进行环化而得，同时消耗一份子O2，产生一份子H2O2。CBGA作为多种大麻素合成的前体，可被多种酶，包括CBDAS和四氢大麻酚酸合成酶（Tetrahydrocannabinolic acid synthase，THCAS）作为底物，分别合成CBDA和四氢大麻酚酸（tetrahydrocannabinolic acid，THCA）。据报道，这两个酶最初在大麻被鉴定，且两种酶在大麻里的酶活性相似。后来研究者们尝试把它们表达在不同的物种里，包括Pichia pastoris，昆虫细胞Spodopterafrugiperda，烟草Tobacco和Komagataellaphaffii，与THCAS不同的是，仅在P. pastoris和K.phaffii可检测到CBDAS活性。Xiaozhou Luo等首次在酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）细胞中从头合成多种大麻素，结果显示，CBDA的产量与THCA相差500倍以上。综上，尽管在大麻植物里，CBDAS和THCAS的酶活性相似，但CBDAS在其他物种体内表达相对THCAS较难，产量也低，这给工业化生物合成CBDA带来困难，故需要改造出产量更高的CBDAS酶，从而提高生产经济效益。

技术实现思路

[0005][技术问题]本专利技术要解决的技术问题是野生型的CBDAS在酿酒酵母中直接表达时活性低，相应地，CBDA产量也低，这给工业化生物合成CBDA带来困难。
[0006][技术方案]本专利技术利用定点突变对CBDAS进行改造，得到多个活性提高的CBDAS突变体。本专利技术利用酿酒酵母表达得到了这些活性提高的CBDAS突变体，这些突变体可在酵母胞内合成
CBDA，且CBDA的产量得到了提高。
[0007]本专利技术披露了大麻二酚酸合成酶突变体（CBDAS突变体）是如下（a）或（b）：（a）氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第56位天冬酰胺、第213位组氨酸、第256位甲硫氨酸、第116位丝氨酸、第343位谷氨酰胺、第362位天冬氨酸、第365位天冬酰胺、第398位谷氨酰胺、第446位半胱氨酸、第474位赖氨酸中的一个或多个进行取代得到的；（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有大麻二酚酸合成酶活性的由（a）衍生的蛋白质。
[0008]本专利技术的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第56位天冬酰胺替换为组氨酸。
[0009]本专利技术的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第213位组氨酸替换为天冬氨酸。
[0010]本专利技术的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第256位甲硫氨酸替换为异亮氨酸，或，将第256位甲硫氨酸替换为异亮氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸。
[0011]本专利技术的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第343位谷氨酰胺替换为谷氨酸，或，将第343位谷氨酰胺替换为谷氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸。
[0012]本专利技术的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第365位天冬酰胺替换为赖氨酸，或，将第365位天冬酰胺替换为赖氨酸并将第362位天冬氨酸替换为丙氨酸，或，将第365位天冬酰胺替换为赖氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸，或，将第362位天冬氨酸替换为丙氨酸、第365位天冬酰胺替换为赖氨酸，以及第116位丝氨酸替换为丙氨酸。
[0013]本专利技术的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第398位谷氨酰胺替换为赖氨酸，或，将第398位谷氨酰胺替换为赖氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸。
[0014]本专利技术的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第446位半胱氨酸替换为丙氨酸。
[0015]本专利技术的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第474位赖氨酸替换为谷氨酰胺。
[0016]本专利技术还披露带有信号肽的CBDAS突变体，所述信号肽的氨基酸序列如SED ID NO：1的第1~28位所示，或者如SEQ ID NO:2所示。
[0017]本专利技术还披露了携带编码CBDAS突变体的基因的核酸构建体，例如，携带编码CBDAS突变体的基因的表达载体。所述的重组表达载体可通过本领域常规方法将本专利技术所述的CBDAS点突变体连接到各种市售的空载体上构建而成。所述的市售的空载体可以是常规的质粒载体，只要能满足在相应的表达宿主中正常复制、可通过如抗生素或营养缺陷筛选的、可正常表达CBDAS点突变体的载体即可。本领域的技术人员都清楚如何选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大麻二酚酸合成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第56位天冬酰胺替换为组氨酸；或者，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第213位组氨酸替换为天冬氨酸；或者，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第256位甲硫氨酸替换为异亮氨酸，或，将第256位甲硫氨酸替换为异亮氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸；或者，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第343位谷氨酰胺替换为谷氨酸，或，将第343位谷氨酰胺替换为谷氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸；或者，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，将第365位天冬酰胺替换为赖氨酸，或，将第365位天冬酰胺替换为赖氨酸并将第362位天冬氨酸替换为丙氨酸，或，将第365位天冬酰胺替换为赖氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸，或，将第362位天冬氨酸替换为丙氨酸、第365位天冬酰胺替换为赖氨酸，以及第116位丝氨酸替换为丙氨酸；或者，所述突变体的氨基酸序列是以SED ID NO：1所示序列的第29位至544位为基础，...

【专利技术属性】
技术研发人员：许薷方，敖悦，陈嘉威，胡瑾瑜，罗小舟，
申请(专利权)人：森瑞斯生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：