一种嵌合抗原受体、CAR-T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有CD3γ细胞内信号区的嵌合抗原受体，属于生物医药技术领域。本发明专利技术还公开了一种CAR

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体、CAR
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T细胞及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种嵌合抗原受体、CAR
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T细胞及其应用。

技术介绍

[0002]CAR
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T细胞疗法在治疗恶性血液系统肿瘤方面显示出了令人鼓舞的疗效，然而针对实体瘤，复杂的肿瘤微环境限制了CAR
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T细胞的功效，阻碍了CAR
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T细胞疗法的广泛使用。CAR
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T细胞免疫治疗面临的障碍主要包括CAR
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T细胞易耗竭、向肿瘤部位的趋化能力和浸润性差、肿瘤抗原逃逸和异质性以及复杂的免疫抑制肿瘤微环境等问题。为了克服这些局限性并将CAR
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T细胞的用途扩大到更广泛的恶性肿瘤，有必要使传统CAR超越常规结构设计出全新的“超级”CAR，让CAR
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T细胞具备更强大更完善的“武器装备”。
[0003]经典CAR结构由肿瘤抗原结合区、铰链区、跨膜区和细胞内信号区组成。细胞外抗原结合区通常是来自单克隆抗体的单链抗体(scFv)，它以主要组织相容性复合体(MHC)非依赖的方式特异性结合肿瘤抗原。细胞内信号区由触发T细胞激活的信号域组成。第一代CAR只有一个CD3ζ结构域；第二代包含CD3ζ结构域和一个共刺激结构域(CD28或4
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1BB)；第三代包含CD3ζ结构域和两个共刺激结构域(CD28+OX40或CD28+4
‑
1BB)；第四代CAR在第二代的基础上添加了促炎症细胞因子和共刺激配体，比如IL
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7、IL
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12等；第五代CAR也是在二代CAR的基础上，在CD3ζ和CD28信号域之间额外插入源自IL
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2受体β链(IL
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2Rβ)截短的胞质域和在CD3ζ的C末端融合一段用于结合酪氨酸
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XX
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谷氨酰胺基序(YXXQ)的STAT3/5(转录因子)序列。
[0004]当CAR
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T细胞特异性识别结合肿瘤抗原时，可募集酪氨酸激酶(Lck)将免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)上的酪氨酸残基磷酸化，ITAM的磷酸化随后引起ZAP
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70酪氨酸激酶的募集和活化，进而引起LAT、SLP
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76、Ras
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MAP等下游通路信号分子的活化，使CAR
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T细胞激活并杀伤肿瘤细胞。因此，ITAM在CAR
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T细胞信号转导中发挥着关键作用。目前已报道的CAR结构大多是以第一代CAR结构为基础，采用包含3个ITAM的CD3ζ作为第一激活信号。虽然都是工程化组合不同信号分子结构域，但仍局限在原始结构域的基础上进行改构。比如使用CD3ζ链信号传导基序的天然序列(包含3个ITAM)，或者使用CD28、4
‑
1BB的胞内信号传导结构域的原始序列，对结构域本身并未做任何工程化改造。特别是CAR设计中最重要的CD3ζ第一信号结构域，几乎全都是包含3个ITAM的胞内全长序列。
[0005]CD3是在T细胞上发现的一种跨膜蛋白，有四种亚型即CD3δ、CD3ε、CD3γ和CD3ζ，其中CD3δ/CD3ε、CD3γ/CD3ε构成异源二聚体。所有CD3链在其细胞质结构域中都含有ITAM。一条CD3ζ链含有3个ITAM，而一条CD3δ/CD3ε/CD3γ链各含有1个ITAM。其中，CD3γ不仅在T细胞激活过程中发挥信号转导的作用，还能动态调节细胞膜表面TCR的表达。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种嵌合抗原受体，具有CD28和CD3γ的细胞内
信号区，可在T细胞激活过程中发挥靶向识别和信号转导作用。
[0007]本专利技术的目的还在于提供一种CAR
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T细胞，可表达具有CD28和CD3γ的细胞内信号区的嵌合抗原受体，能够显著抑制肿瘤的生长，延长小鼠生存期。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体具有CD28和CD3γ的细胞内信号区，所述CD3γ的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]优选的，所述CD3γ的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]优选的，所述嵌合抗原受体由CD8信号肽、HER2单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜结构区、CD28和CD3γ的细胞内信号区串联组成。
[0012]优选的，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013]优选的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0014]本专利技术还提供了一种CAR
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T细胞，所述CAR
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T细胞表达上述的嵌合抗原受体。
[0015]本专利技术还提供了一种慢病毒表达载体，所述载体包含上述嵌合抗原受体的核苷酸序列。
[0016]本专利技术还提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒包含上述慢病毒表达载体。
[0017]优选的，所述重组慢病毒采用上述慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒共转染哺乳细胞制备得到。
[0018]本专利技术还提供了上述CAR
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T细胞在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的技术方案的有益效果如下：
[0020]本专利技术制备得到的嵌合抗原受体，具有CD28和CD3γ的细胞内信号区，可在T细胞激活过程中发挥靶向识别和信号转导作用，同时能动态调节细胞膜表面TCR的表达。
[0021]本专利技术制备得到的Zeta
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CAR
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T、G
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CAR
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T细胞均能显著抑制肿瘤的生长，特异性的杀伤肿瘤细胞。改构后的G
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CAR
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T相对于传统的Zeta
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CAR
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T的抑瘤效果更显著，G
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CAR
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T产生细胞因子水平显著降低，诱发细胞因子风暴的风险大幅下降，并且G
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CAR
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T细胞的穿孔素水平略高于Zeta
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CAR
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T细胞，G
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CAR
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T治疗的小鼠生存期最长。
附图说明
[0022]图1：Zeta
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CAR和G
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CAR的CAR结构。
[0023]图2：流式细胞术检测T细胞分选效果；A：Control；B：未分选；C：分选后。
[0024]图3：流式细胞术检测CAR
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T细胞制备效果。
[0025]图4：荧光显微镜观察不同结构CAR
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有CD28和CD3γ的细胞内信号区，所述CD3γ的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD3γ的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8信号肽、HER2单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜结构区、CD28和CD3γ的细胞内信号区串联组成。4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。5.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨安钢，阎博，王鹏举，王依依，张仪婷，贾林涛，赵晶，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：