无PAM限制的腺嘌呤单碱基编辑产品、方法和应用技术

本申请公开了一种无PAM限制的腺嘌呤单碱基编辑产品、方法和应用。所述产品包括融合蛋白，其包括如下两部分：腺嘌呤核苷脱氨酶和核酸内切酶，所述腺嘌呤核苷脱氨酶的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列，所述核酸内切酶的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示序列。所述产品能在细胞尤其是造血干/祖细胞的基因中实现不受PAM限制的引入A>G替换编辑，通过编辑后的患者自体造血干细胞进行回输，能实现长效、彻底治愈疾病的目的。所述产品应用于修复β

【技术实现步骤摘要】
无PAM限制的腺嘌呤单碱基编辑产品、方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质改造
，具体涉及一种无PAM限制的腺嘌呤单碱基编辑产品、方法和应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9基因编辑系统能在DNA的特定部位进行切割，产生DNA双链断裂(DSB)，而细胞内存在非同源末端连接和同源重组修复两种修复机制，从而实现对基因组的编辑。但初代的CRISPR技术涉及DNA双链断裂，会引起潜在的风险。单碱基基因编辑系统的开发，能够在不引起DNA双链断裂的情况下实现对特定基因位点的精确修饰。单碱基基因编辑系统中碱基编辑器主要由两个部分组成：Cas蛋白和DNA修饰酶。迄今为止，已经开发出两类碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器(CBE)，实现C>T(由C到T)的转化；腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，实现A>G(由A到G)的转化。
[0003]自2017年最初被专利技术以来，ABE在应用的过程中受到编辑效率和编辑范围的限制。其一，已有的第七代ABE即ABE7.10max在人造血干/祖细胞中编辑效率极低甚至接近0，这限制了ABE在造血干/祖细胞中的应用。其二，由于ABE的编辑范围仍受到Cas蛋白部分的影响，如已有的核酸酶SpCas9受NGG PAM限制，这大大限制了腺嘌呤碱基编辑器在全基因组的应用范围。
[0004]科研人员在今年做出了许多突破性的研究。2020年3月David.R.liu研究组通过噬菌体辅助进化获得了脱氨效率和其他种属Cas兼容性都有极大提升的第八代脱氨酶Tad8e，另外，2020年4月，Beam Therapeutics的科学家也通过另一策略即基于ABE7.10所携带的突变进行各已有突变位点氨基酸饱和突变的实验，获得了在造血干/祖细胞中脱氨效率显著提高的第八代脱氨酶ABE8s，同年，在2020年3月，Benjamin P.Kleinstiver研究组通过基于结构的改造获得了几乎不受PAM限制的SpCas9突变体Cas9-SPRY。
[0005]β-地中海贫血是一种常见的由于β-珠蛋白基因缺陷导致成人血红蛋白异常的遗传性疾病，我国“地贫”基因携带者约3000万人，其中重型和中间型“地贫”患者约30万人。IVS2-654C>T基因型是我国“地贫”中较为多见的一种，发病机制为HBB基因第2内含子中的第654位碱基发生C>T(由C到T)突变，从而产生异常剪接位点，导致β-珠蛋白mRNA中额外多出了73nt的外显子并提前终止翻译。该突变位点互补链上对应的突变虽然为ABE理论上可修复的(G>A)，但由于互补链上包含突变位点(G>A)在内的区域无合适ABE7.10发挥作用的PAM，加之ABE7.10在造血干/祖细胞编辑效率的限制，一直不能通过单碱基编辑的方式实现该致病突变的有效修复。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种无PAM限制的腺嘌呤单碱基编辑产品、方法和应用。
[0007]本专利技术针对以上限制ABE应用于人造血干/祖细胞的两大瓶颈，在以上现有技术的
基础上，首次将ABE8e和Cas9-SPRY结合，一方面，拓展了ABE的编辑范围，使得在原本没有合适sgRNA的基因组区域可以通过制造A>G的突变来模拟疾病模型或者修复致病突变，另一方面，为人造血干/祖细胞相关疾病治疗尤其是无PAM的点突变导致的疾病治疗提供了一种新的途径。
[0008]本专利技术能在细胞尤其是造血干/祖细胞的基因中实现不受PAM限制的引入A>G替换编辑，通过编辑后的患者自体造血干/祖细胞进行回输，能实现长效、彻底治愈疾病的目的。
[0009]一方面，本专利技术提供了一种无PAM限制的腺嘌呤单碱基编辑用融合蛋白，包括如下两部分：腺嘌呤核苷脱氨酶和核酸内切酶，
[0010]所述腺嘌呤核苷脱氨酶的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列(ABE8e)、或与SEQ ID No.1所示序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上同源性的序列，优选，SEQ ID No.1所示序列，
[0011]所述核酸内切酶的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示序列(Cas9-SPRY)、或与SEQ ID No.2所示序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上同源性的序列，优选，SEQ ID No.2所示序列。
[0012]在上述融合蛋白中，所述融合蛋白的两个部分的连接顺序可以为：所述腺嘌呤核苷脱氨酶位于所述核酸内切酶的N端或C端，优选的，所述腺嘌呤核苷脱氨酶位于所述核酸内切酶的N端。
[0013]本专利技术提供的所述融合蛋白为一种新蛋白，可以解决腺嘌呤碱基编辑器在造血干/祖细胞中应用遇到的编辑效率低和/或编辑范围受PAM限制的问题，
[0014]具体地，如本专利技术具体实施方式中，ABE7.10在造血干/祖细胞中进行腺嘌呤碱基编辑的效率为0，运用本专利技术提供的所述融合蛋白(实施例中的名称为ABE-SPRY)不仅可以在正常位点利用NGG PAM的sgRNA引入A>G替换，如BCL11A基因增强子区域NGG PAM的sgRNA——sg1620所在位点(PAM为GGG)，还可以在正常位点利用非NGG PAM的sgRNA引入A>G替换，如基因间区非NGG PAM的sgRNA——sgNACT-2(PAM为GGCT)所在位点。运用ABE-SPRY更大的意义在于能在基因组宽范围、高效率引入防病或保护性或具有疾病缓解效果的A>G(互补链对应引入的突变则为T>C)突变，或修复致病的G>A突变(互补链对应致病突变则是C>T)。如修复HBB(β-珠蛋白基因)导致内含子异常剪接的IVS2-654 C>T(即互补链上的突变为G>A)突变，而适合ABE引入A>G替换来修复该突变位点的sgRNA都是非NGG PAM。
[0015]基于本专利技术的以上贡献，本专利技术还保护如下生物材料：
[0016]一方面，本专利技术保护一种核酸分子，所述核酸分子能够编码以上任一所述融合蛋白，所述核酸分子包括DNA分子和/或RNA分子，所述RNA分子包括真核mRNA和/或病毒RNA，
[0017]优选的，所述融合蛋白中所述腺嘌呤核苷脱氨酶的DNA编码序列如SEQ ID No.3所示、或与SEQ ID No.3所示序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上同源性的序列，
[0018]优选的，所述融合蛋白中所述核酸内切酶的DNA编码序列如SEQ ID No.4所示、或与SEQ ID No.4所示序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上同源性的序列。
[0019]另一方面，本专利技术还保护一种重组载体，所述重组载体含有所述核酸分子，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无PAM限制的腺嘌呤单碱基编辑用融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括如下两部分：腺嘌呤核苷脱氨酶和核酸内切酶，所述腺嘌呤核苷脱氨酶的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列、或与SEQ ID No.1所示序列具有80％以上同源性的序列，优选，SEQ ID No.1所示序列，所述核酸内切酶的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示序列、或与SEQ ID No.2所示序列具有80％以上同源性的序列，优选，SEQ ID No.2所示序列。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的两个部分的连接顺序为：所述腺嘌呤核苷脱氨酶位于所述核酸内切酶的N端或C端，优选的，所述腺嘌呤核苷脱氨酶位于所述核酸内切酶的N端。3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子能够编码权利要求1或2所述融合蛋白，所述核酸分子包括DNA分子和/或RNA分子，所述RNA分子包括真核mRNA和/或病毒RNA，优选的，所述融合蛋白中所述腺嘌呤核苷脱氨酶的DNA编码序列如SEQ ID No.3所示、或与SEQ ID No.3所示序列具有80％以上同源性的序列，优选的，所述融合蛋白中所述核酸内切酶的DNA编码序列如SEQ ID No.4所示、或与SEQ ID No.4所示序列具有80％以上同源性的序列。4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3所述核酸分子，所述重组载体包括病毒载体、和/或非病毒载体；所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、和/或溶瘤病毒载体，所述非病毒载体包括阳离子高分子聚合物、脂质体、和/或质粒载体。5.一种重组细胞或重组菌，其特征在于，含有权利要求1或2所述融合蛋白、或权利要求3所述核酸分子、或权利要求4所述重组载体；优选的，所述重组细胞为造血干/祖细胞或红系祖细胞，更优选的，所述造血干/祖细胞为CD34
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的造血干/祖细胞，优选的，所述重组细胞来源于哺乳动物，更优选的，来源于人。6.一种单碱基基因编辑系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1或2所述融合蛋白、和/或权利要求3所述核酸分子、和/或权利要求4所述重组载体、和/或权利要求5所述重组细胞或重组菌、和/或sgRNA，所述sgRNA引导所述融合蛋白对细胞中的基因靶位点进行单碱基基因编辑；优选的，所述细胞为造血干/祖细胞或红系祖细胞；更优选的，所述基因靶位点为HBB基因的IVS2-654 C>T突变位点，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID No.7-11中至少一种，更优选，SEQ ID No.8、9、10中至少一种，和/或，所述基因靶位点为HBB基因的IVS1-110 G>A突变位点，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID No.26、27、28、29、30、31、和32中至少一种，和/或，所述基因靶位点为HBB基因的Hb E G>A突变位点，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID No.33、34、35、36、37、38、和39中至少一种。7.权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述重组载体、权利要求5所述重组细胞或重组菌、权利要求6所述单碱基基因编辑系统在制备基因编辑产品、疾病治疗和/或预防产品、动物模型或植物新品种中的应用；优选的，所述基因编辑产品针对的细胞为造血干/祖细胞或红系祖细胞，更优选的，所
述造血干/祖细胞为CD34
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的造血干/祖细胞，优选的，所述基因编辑产品所编辑的靶位点为附近无PAM的基因组位点，所述细胞来源于哺乳动物，更优选的，来源于人，所述疾病包括β-地中海贫血，更优选的，所述β-地中海贫血由包括IVS2-654 C>T、IVS1-110 G>A、和/或Hb E G>A的突变导致。8.一种针对细胞中由于HBB(β-珠蛋白基因)IVS2-654 C>T突变导致内含子异常剪接的修复方法，所述IVS2-654 C>T的突变引入额外的剪接供体位点导致内含子异常剪接，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宇轩，陈双红，廖娇阳，蒋艳红，萧圣霖，刘明耀，席在喜，
申请(专利权)人：上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：