一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用，涉及透明质酸酶制备技术领域。重组长效人透明质酸酶为人免疫球蛋白IgG1Fc片段和人透明质酸酶PH20细胞外部分的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术提供的重组长效人透明质酸酶具有安全性高、半衰期长、体内活性高的优势，融合的多肽属于人源蛋白质，具有较低的免疫原性，体内使用更安全。本发明专利技术构建了表达PH20－IgFc融合蛋白的真核表达载体，并且获得了稳定表达PH20－IgFc融合蛋白的基因工程CHO细胞系。IgFc融合蛋白的基因工程CHO细胞系。

【技术实现步骤摘要】
一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用


[0001]本专利技术涉及透明质酸酶制备
，具体而言，涉及一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用。

技术介绍

[0002]透明质酸(HA)又名玻尿酸，是由N
‑
乙酰氨基葡萄糖与D
‑
葡萄糖醛酸为双糖单位聚合而成的糖胺聚糖，其双糖单位中的N
‑
乙酰氨基葡萄糖与D
‑
葡萄糖醛酸以β
‑
1，3糖苷键相连，双糖单位之间则以β
‑
1，4糖苷键进行聚合。由于双糖单位聚合度的差异，导致透明质酸的分子量分布较为宽泛，天然的HA主要以高分子透明质酸(HMWHA，Mr2
×
106Da)方式存在。分子量是决定HA生物学功能的重要参数。细胞外基质的主要成分是HMW HA，其高粘弹性是细胞外基质得以抵抗外界压缩力的根源，依赖于高粘弹性，HMW HA也用于眼科手术。低分子量透明质酸(LMW HA，1
×
105DaMr2
×
106Da)具有良好的保湿性和润滑性，广泛用于化妆品；研究发现，超低分子量透明质酸(VLMW HA，Mr1
×
105Da)具有促血管生成作用、促创伤愈合作用、免疫调节活性和抗肿瘤活性，在机体愈合、免疫增强和肿瘤治疗等领域有重要的潜在应用价值。
[0003]人源性透明质酸酶主要有三种:HAase 1、HAase 2和PH20,其中 PH20是降解人体内HA的主要酶类。透明质酸酶可以降解人工生产的重组大分子量透明质酸，产生出小分子量透明质酸。目前，市售的透明质酸酶大多为国外企业垄断，且种类较少。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用以解决上述技术问题。
[0006]本专利技术是这样实现的：
[0007]本专利技术提供了一种重组长效人透明质酸酶，重组长效人透明质酸酶为人免疫球蛋白IgG1Fc片段和人透明质酸酶PH20细胞外部分的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]本专利技术提供的重组长效人透明质酸酶具有安全性高、半衰期长、体内活性高的优势，属于人源蛋白质，体内使用更安全。
[0009]本专利技术还提供了一种重组长效人透明质酸酶的编码基因，其具有如SEQ ID No.2所示的序列。
[0010]本专利技术还提供了一种表达载体，其包括上述重组长效人透明质酸酶的编码基因。
[0011]本专利技术还提供了一种宿主细胞，其包括上述的重组长效人透明质酸酶的编码基因。在一种可选的实施方式中，上述宿主细胞选自CHO 细胞。
[0012]本专利技术还提供了一种生产重组长效人透明质酸酶的方法，方法包括：使用动物细胞表达载体pMH2或pMH7在中国地仓鼠细胞CHO 内表达基因序列SEQ ID No.2以获得的
PH20
‑
IgFc融合蛋白，然后进行分离纯化即得；表达载体pMH2和pMH7的基因序列参照 http://www.biovector.net/提供的载体序列，可市售购买或合成获得。
[0013]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述PH20
‑
IgFc使用ProteinG亲和纯化方法进行分离纯化。
[0014]本专利技术还提供了一种重组长效人透明质酸酶制剂，其包括上述重组长效人透明质酸酶或由上述方法制备的重组长效人透明质酸酶，制剂包括200
‑
1200IU的重组长效人透明质酸酶，10
‑
15mM Na2HPO4， 0.01
‑
0.03％CaCl2，0.1
‑
0.2％EDTA
‑
Na2，145
‑
150mM NaCl，0.1
‑
0.2％ HSA，0.1
‑
0.15％甘露醇，且pH值为5
‑
6。
[0015]例如：200、500、700、800、900、1000、1200IU的重组长效人透明质酸酶。
[0016]本专利技术还提供了一种复方制剂，包括重组长效人透明质酸酶制剂和药物。
[0017]上述复方制剂的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂。
[0018]在一种可选的实施方式中，上述复方制剂还包括药学上可接受的盐或赋形剂。
[0019]在一种可选的实施方式中，上述药物为实体瘤治疗药物。实体瘤包括不限于头颈部肿瘤(例如喉癌)、胸部肿瘤(例如乳腺癌、肺癌)、消化系统肿瘤(例如胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌)、泌尿生殖系统肿瘤(例如卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌)、骨肿瘤、中枢神经系统肿瘤、软组织肿瘤、皮肤及附件肿瘤等。
[0020]本专利技术还提供了一种重组长效人透明质酸酶或由上述方法制备的重组长效人透明质酸酶在制备配合使用药物的用途，人透明质酸酶制备的配合使用药物用于在其活性不被降解的情况下传递到人免疫球蛋白结合的组织或器官；或用于将特定治疗药物传递到疾病所在的组织或器官。
[0021]上述配合使用药物的用途包括不限于：化疗，放射疗法，光敏剂，光热剂或免疫疗法。
[0022]本专利技术还提供了重组长效人透明质酸酶或上述方法制备的重组长效人透明质酸酶在制备化学偶联剂的用途，人透明质酸酶制备的化学偶联剂用于通过重组长效透明质酸酶的IgFc提供非功能位点来化学偶联诊断剂、显影剂、药物、治疗用毒素、基因进入疾病组织器官。
[0023]在一种可选的实施方式中，将上述方法制备的重组长效人透明质酸酶用于皮下输液、眼周手术麻醉、化药和生物药促渗、尿路造影术中造影剂的吸收。
[0024]本专利技术具有以下有益效果：
[0025]本专利技术提供的重组长效人透明质酸酶具有安全性高、半衰期长、体内活性高的优势，两段多肽属于人源蛋白质，具有较低的免疫原性，体内使用更安全。本专利技术构建了表达PH20－IgFc融合蛋白的真核表达载体，并且获得了稳定表达PH20－IgFc融合蛋白的基因工程 CHO细胞系。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这
些附图获得其他相关的附图。
[0027]图1为本专利技术提供的融合蛋白PH20－IgFc 37℃稳定性试验结果示意图。
具体实施方式
[0028]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组长效人透明质酸酶，其特征在于，所述重组长效人透明质酸酶为人免疫球蛋白IgG1Fc片段和人透明质酸酶PH20细胞外部分的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种重组长效人透明质酸酶的编码基因，其特征在于，其具有如SEQ ID No.2所示的序列。3.一种表达载体，其特征在于，其包括权利要求2所述的重组长效人透明质酸酶的编码基因。4.一种宿主细胞，其特征在于，其包括权利要求2所述的重组长效人透明质酸酶的编码基因。5.一种生产重组长效人透明质酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括：使用动物细胞表达载体pMH2或pMH7在中国地仓鼠细胞CHO内表达基因序列SEQ ID No.2以获得PH20
‑
IgFc融合蛋白，然后进行分离纯化即得。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PH20
‑
IgFc使用Protein G亲和纯化方法进行分离纯化。7.一种重组长效人透明质酸酶制剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的重组长效人透明质酸酶或权利要求5
‑
6任一项所述的方法制备的重组长效人透明质酸酶，所述制剂包括200
‑
1200IU的重组长效人透明质酸酶，10
‑
1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王一，顾耀东，俞婷婷，梁译冰，赵子言，
申请(专利权)人：江苏雅酶医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：