一种嵌合抗原受体、CAR-T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种嵌合抗原受体、CAR

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体、CAR
‑
T细胞及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种嵌合抗原受体、CAR
‑
T细胞及其应用。

技术介绍

[0002]CAR
‑
T细胞疗法在治疗恶性血液系统肿瘤方面显示出了卓越的疗效，然而针对实体瘤，复杂的肿瘤微环境限制了CAR
‑
T细胞的功效，阻碍了CAR
‑
T细胞疗法的广泛使用。CAR
‑
T细胞免疫治疗面临的障碍主要包括CAR
‑
T细胞易耗竭、向肿瘤部位的趋化能力和浸润性差、肿瘤抗原逃逸和异质性以及复杂的免疫抑制肿瘤微环境等问题。同时CAR
‑
T细胞在应用中仍然存在副作用较大，如引起严重的细胞因子释放综合征，产生强烈的炎症反应。为了克服这些局限性并将CAR
‑
T细胞的用途扩大到更广泛的恶性肿瘤，有必要使传统CAR超越常规结构设计出全新的“超级”CAR，让CAR
‑
T细胞具备更强大更完善的“武器装备”。
[0003]经典CAR结构由肿瘤抗原结合区、铰链区、跨膜区和细胞内信号区组成。细胞外抗原结合区通常是来自单克隆抗体的单链抗体(scFv)，它以主要组织相容性复合体(MHC)非依赖的方式特异性结合肿瘤抗原。细胞内信号区由触发T细胞激活的信号域组成。第一代CAR只有一个CD3ζ结构域；第二代包含CD3ζ结构域和一个共刺激结构域(CD28或4
‑
1BB)；第三代包含CD3ζ结构域和两个共刺激结构域(CD28+OX40或CD28+4
‑
1BB)；第四代CAR在第二代的基础上添加了促炎症细胞因子和共刺激配体，比如IL
‑
7、IL
‑
12等；第五代CAR也是在二代CAR的基础上，在CD3ζ和CD28信号域之间额外插入源自IL
‑
2受体β链(IL
‑
2Rβ)截短的胞质域和在CD3ζ的C末端融合一段用于结合酪氨酸
‑
XX
‑
谷氨酰胺基序(YXXQ)的STAT3/5(转录因子)序列。
[0004]CD3是在T细胞上发现的一种跨膜蛋白，有四种亚型即CD3δ、CD3ε、CD3γ和CD3ζ，其中CD3δ/CD3ε、CD3γ/CD3ε构成异源二聚体。其中CD3ε链是一种单次I型跨膜蛋白，包含1个免疫球蛋白样结构域和1个ITAM结构域。当CAR
‑
T细胞特异性识别结合肿瘤抗原时，可募集酪氨酸激酶(Lck)将ITAM上的酪氨酸残基磷酸化，ITAM的磷酸化随后引起ZAP
‑
70酪氨酸激酶的募集和活化，进而引起LAT、SLP
‑
76、Ras
‑
MAP等下游通路信号分子的活化，使CAR
‑
T细胞激活并杀伤肿瘤细胞。因此，ITAM在CAR
‑
T细胞信号转导中发挥着关键作用。目前已报道的CAR结构大多是以第一代CAR结构为基础，采用包含3个ITAM的CD3ζ作为第一激活信号。虽然都是工程化组合不同信号分子结构域，但仍局限在原始结构域的基础上进行改造结构。比如使用CD3ζ链信号传导基序的天然序列(包含3个ITAM)，或者使用CD28、4
‑
1BB的胞内信号传导结构域的原始序列，对结构域本身并未做任何工程化改造。

技术实现思路

[0005]鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种嵌合抗原受体、CAR
‑
T细胞和应用，本专利技术选择仅含有一个ITAM基序的CD3ε作为第一激活信号，制备具有“新型结构”的CAR
‑
T细胞，改构后的CAR
‑
T细胞产生细胞因子水平显著降低，诱发细胞因子风暴的风险大幅下降，安全性更
高，抑瘤效果更显著。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体具有CD28和CD3ε的细胞内信号区，所述CD3ε的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]优选地，所述CD3ε的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]优选地，所述嵌合抗原受体由CD8信号肽、HER2单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜结构区、CD28细胞内信号区和CD3ε细胞内信号区依次串联组成。
[0010]优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011]优选地，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0012]本专利技术还提供了一种CAR
‑
T细胞，所述CAR
‑
T细胞表达任一上述嵌合抗原受体。
[0013]本专利技术还提供了一种慢病毒表达载体，所述载体包括上述核苷酸序列。
[0014]本专利技术还提供了一种重组慢病毒，所述慢病毒包括上述载体。
[0015]优选地，所述重组慢病毒采用上述慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒共转染哺乳细胞制备得到。
[0016]本专利技术还提供了一种CAR
‑
T细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0018]本专利技术提供的嵌合抗原受体选择仅含有一个ITAM基序的CD3ε作为第一激活信号，同时以靶向HER2人源化单链抗体P1h2作为CAR分子的胞外抗原结合区元件，在胞内共刺激信号CD28末端融合CD3ε单一ITAM序列，制备具有“新型结构”的CAR
‑
T细胞。
[0019]本专利技术的CAR
‑
T细胞能特异性的杀伤肿瘤细胞，且改构后的CAR
‑
T产生细胞因子水平显著降低，诱发细胞因子风暴的风险大幅下降，安全性更高。与传统CAR
‑
T细胞的杀伤肿瘤的效果相比，本专利技术的新型结构的CAR
‑
T细胞具有更显著的抑瘤效果。
附图说明
[0020]图1为Zeta
‑
CAR结构和E
‑
CAR结构的示意图；
[0021]图2为流式细胞术检测T细胞分选效果图，A为Control组，B为分选前PBMC中CD3
+
T细胞比例，C为分选后CD3
+
T细胞比例；
[0022]图3为流式细胞术检测CAR
‑
T细胞制备效果；
[0023]图4为Zeta
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CAR
‑
T和E
‑
CAR
‑
T细胞对靶细胞的杀伤作用(标尺为100μm)，其中UTD表示未转导对照T细胞，HER2
+
PC9为HER2阳性肿瘤细胞，HER2
‑
PC9为HER2阴性肿瘤细胞；
[0024]图5为Zeta
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有CD28和CD3ε的细胞内信号区，所述CD3ε的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD3ε的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8信号肽、HER2单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜结构区、CD28细胞内信号区和CD3ε细胞内信号区依次串联组成。4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。5.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨安钢，阎博，王鹏举，王依依，张仪婷，贾林涛，赵晶，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：