一种含CCL1的融合蛋白、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种含CCL1的融合蛋白、制备方法及应用，所述融合蛋白，自N端至C端依次包括：IgE信号肽、CCL1、linker和抗原，或IgE信号肽、CCL1、linker、抗原和T2片段，所述T2片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明专利技术利用CCL1与DC细胞等免疫细胞表面受体的趋化结合能力将不同的抗原蛋白转运交叉呈递到DC细胞表面，提高了各种抗原蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其防治相关疾病的效果。本发明专利技术中的T2序列经实验测定其具有非常强的免疫增强效果，可以在促进抗原呈递的过程中进一步激发体液和细胞免疫反应，最终达到抑制相关肿瘤生长的效果。肿瘤生长的效果。肿瘤生长的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种含CCL1的融合蛋白、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体来说，涉及一种含CCL1的融合蛋白、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]树突状细胞（Dendritic cells，DC）是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟的DC细胞可以以多种细胞表面蛋白与T细胞结合，并使之激活，将DC细胞本身捕获到的抗原蛋白表位肽最终交叉呈递给T细胞并促使其分化为抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。最终发挥细胞免疫过程对抗原物质进行识别和降解。
[0003]肿瘤疫苗通过免疫增强已有的抗肿瘤反应或启动初始T细胞来诱导患者的效应T细胞功能，抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在抗肿瘤过程中发挥重要作用。DC细胞是唯一能激活初始CD8+T细胞的专职抗原呈递细胞，对细胞外肿瘤抗原通过MHC
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I进行摄取、加工和交叉提呈，对产生有效的CTL至关重要。因此，通过偶联DC细胞表面分子将肿瘤抗原递送至DC细胞是有效诱导CD8+T细胞免疫应答的肿瘤治疗策略。
[0004]目前，已经探明的能够对DC细胞的递呈起到曾强作用的分子包括XCL
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1，但仍亟待探明更多的能够起到促进递呈作用的DC细胞表面分子。

技术实现思路

[0005]针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种含CCL1的融合蛋白、制备方法及应用，能够克服现有技术的上述不足。
[0006]为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种融合蛋白，自N端至C端依次包括：IgE信号肽、CCL1、linker和抗原。
[0007]本专利技术还提供了另外一种融合蛋白，自N端至C端依次包括：IgE信号肽、CCL1、linker、抗原和T2片段，所述T2片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0008]优选地，所述抗原来自病毒、病原菌和/或肿瘤；所述病毒包括HPV、EBV、HCV、HIV、HBV、VZV或冠状病毒中的至少一种；所述肿瘤包括肝癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、血癌、卵巢癌、结直肠癌中的至少一种。
[0009]优选地，所述IgE信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述CCL1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述linker为（G5S）n，其中n为1~10；所述抗原为HPV16的E6蛋白和/或HPV16的E7蛋白，所述HPV16的E6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述HPV16的E7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]本专利技术还提供了编码所述融合蛋白的核酸。
[0011]所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
[0012]本专利技术还提供了含有所述核酸的表达载体，其包括骨架载体和编码所述融合蛋白的核酸。
[0013]本专利技术还提供了转化或转染所述载体的宿主。
[0014]本专利技术还提供了一种所述融合蛋白的制备方法，包括：培养含有编码所述融合蛋白的基因表达载体的宿主，获得含有所述融合蛋白的培养物。
[0015]本专利技术还提供了所述的融合蛋白、所述的基因、所述的表达载体或所述的宿主在制备防治疾病的产品中的应用，所述防治包括预防和/或治疗，具体包括提高血清中抗体水平、预防肿瘤的形成、抑制肿瘤生长，提高机体对肿瘤的免疫反应能力。所述疾病包括由病毒和/或病原菌引起的疾病。或者所述疾病为肿瘤。所述防治疾病的产品包括药物和/或疫苗，给予的方式包括口服、注射和/或电转。
[0016]本专利技术的有益效果：本专利技术利用CCL1与DC细胞等免疫细胞表面受体的趋化结合能力将不同的抗原蛋白转运交叉呈递到DC细胞表面，提高了各种抗原蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其防治相关疾病的效果。本专利技术中的T2序列经实验测定其具有非常强的免疫增强效果，可以在促进抗原呈递的过程中进一步激发体液和细胞免疫反应，最终达到抑制相关肿瘤生长的效果。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]图1为CCL1趋化各类专职抗原提呈细胞能力分析图；图2A为pVR
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CCL1
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E6E7
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T2的质粒图谱；图2B为pVR
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CCL1
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E6E7的质粒图谱；图2C为pVR
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E6E7的质粒图谱；图3为检测pVR
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CCL1
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E6E7
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T2、pVR
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CCL1
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E6E7和pVR
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E6E7的三种质粒目的基因的表达情况，利用蛋白免疫印迹技术（Westernblot）检测C端带有Flag标签的融合蛋白编码核苷酸的表达情况；图4为不同融合基因对小鼠进行预防型免疫用于后期测试特异性T细胞反应的时间轴；图5为不同融合基因对小鼠进行免疫后特异性T细胞反应的流式检测结果；图6为不同融合基因、mRNA和蛋白疫苗分别对小鼠进行预防型免疫和接瘤时间轴；图7为上述预防型免疫的量瘤检测结果图；图8为不同融合基因、mRNA和蛋白疫苗分别对小鼠进行治疗型免疫和接瘤时间轴；图9为上述治疗型免疫的量瘤检测结果图。
具体实施方式
[0019]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel）。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L
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氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
[0021]本专利技术所述CCL1是一种人体内重要的趋化因子，它属于CC趋化因子家族（CC chemokines）中的一员，其可以特异性的在人体T细胞中高水平表达，CCR8为其唯一受体。CCL1
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CCR8 信号对于免疫细胞的迁移和活化有重要作用。本专利技术研究表明CCL1能够用于递送物质到专职抗原提呈细胞，特别是DC细胞，从而增强DC细胞的递呈效果。
[0022]本专利技术中，所述CCL1可为人源片段，也可为其他动物来源的片段，例如鼠源、兔源、猴源、猪源等，其可为完整的CCL1，也可为其中具有C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，自N端至C端依次包括：IgE信号肽、CCL1、linker和抗原。2. 一种融合蛋白，其特征在于，自N端至C端依次包括：IgE信号肽、CCL1、linker、抗原和T2片段，所述T2片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗原来自病毒、病原菌和/或肿瘤；所述病毒包括HPV、EBV、HCV、HIV、HBV、VZV或冠状病毒中的至少一种；所述肿瘤包括肝癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、血癌、卵巢癌、结直肠癌中的至少一种。4. 根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述IgE信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述CCL1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述linker为（G5S）n...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢皇帆，孙志娟，许红岩，王凤，
申请(专利权)人：保定诺未科技有限公司，
类型：发明
国别省市：