一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途技术

本发明专利技术属于应用分子生物学领域，具体涉及一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途。该内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒含有MS2噬菌体外壳蛋白和包裹在所述外壳蛋白内部的重组基因S序列，所述S序列由依次相连的新型冠状病毒ORF1ab基因片段、人β‑Globin基因片段、新型冠状病毒N基因片段和E基因片段组成；所述S序列具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。该病毒样颗粒可用于新型冠状病毒核酸提取、扩增和检测全程质控，作为试剂盒中的新型冠状病毒的阳性对照和内标质控品推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途
本专利技术属于应用分子生物学领域，具体涉及一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途。
技术介绍
新型冠状病毒肺炎(CoronaVirusDisease2019，COVID-19)，是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2,SARS-CoV-2)引起人发热、乏力、干咳和呼吸困难，严重者并发急性呼吸窘迫综合征的传染病。其传染性强、可感染各年龄段的人，特别是对有基础疾病的老年人可导致较高的发病率和死亡率。目前，国内外许多研究者建立了各种病原体分子生物学诊断方法，主要包括抗原和核酸的检测。但是，在核酸，尤其是在RNA病原体的实际检测中，带有核酸的阳性质控品(企业参考品)不可或缺。质粒DNA制备的阳性质控品，不能监控提取和反转录步骤；由于环境中Rnase的存在，裸漏的RNA制备的阳性质控品，稳定性差；完整的病毒难于大量获得，同时存在严重的生物安全性风险。目前由于无生物安全危险、稳定性好、不容易降解的阳性质控物以及内标质控品的缺乏，使得新型冠状病毒的核酸检测很难做到从提取、反转录到扩增的全程监控。包含MS2噬菌体成熟酶蛋白、外壳蛋白和PAC位点基因的重组载体在原核表达系统中可在体外包装RNA形成假病毒样颗粒作为阳性对照。病毒样颗粒的快速纯化和颗粒溶液中残余核酸的彻底去除是一个关键因素。目前，病毒样颗粒的常用纯化方法主要有：PEG沉淀法、密度梯度离心法、凝胶过滤层析、超滤法等，四种方法得到的装甲RNA病毒颗粒溶液中均有大量大肠杆菌自身和重组质粒DNA的残留，特别是重组质粒DNA的残留。同时，PEG沉淀法得到的病毒样颗粒纯度不高，时间长；凝胶过滤层析在纯化病毒样颗粒时，需要先粗纯，最后再用分子筛，但其上样量小，时间长；密度梯度离心法虽然纯度高，但时间长，不能大量制备，需要超速离心机；超滤法不能去除大分子杂质蛋白，纯度不高，每次纯化量少，损失多。
技术实现思路
本专利技术提供一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，以便于实现新型冠状病毒的核酸检测从提取、反转录到扩增的全程监控。本专利技术的第二目的在于提供所述内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的纯化方法。该纯化方法可实现所述内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的高效纯化，且制得的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的纯度高，可用作新型冠状病毒的核酸检测的阳性质控品。本专利技术的第三目的在于提供所述内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的制备方法。此外，本领域一般采用DNase和Rnase对制备得到的病毒样颗粒中残留的DNA或RNA进行消化去除。专利技术人在制备所述内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的过程中还发现，在NP40存在的条件下，DNase和RNase不能彻底消化病毒样颗粒溶液中的DNA。专利技术人通过采用全能核酸酶Benzonase，可以较彻底消化溶液中DNA，从而解决在NP40存在的条件下，DNase和RNase不能彻底消化病毒样颗粒溶液中的DNA的技术问题。本专利技术的第四目的在于提供所述内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的用途。本专利技术还提供了一种试剂盒。本专利技术的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒采用如下技术方案：一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒含有MS2噬菌体外壳蛋白和包裹在所述外壳蛋白内部的重组基因S序列，所述S序列由依次相连的新型冠状病毒ORF1ab基因片段、人β-Globin基因片段、新型冠状病毒N基因片段和E基因片段组成；所述S序列具有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。作为进一步优选的技术方案，所述病毒样颗粒的制备包括下述步骤：(1)构建能够表达所述病毒样颗粒的表达载体，并将所述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌体；(2)诱导所述重组菌体，使其表达所述病毒样颗粒；(3)收集菌体，并加入裂解液，超声、破碎菌体以获取所述病毒样颗粒；(4)纯化所述病毒样颗粒；(5)采用核酸酶对经步骤(4)纯化所得的含有病毒样颗粒的溶液进行消化，以除去溶液中残留的DNA和RNA。作为进一步优选的技术方案，所述裂解液包括NaCL、Tris-HCL、EDTA、甘油和NP40；优选的，所述裂解液包括NaCL200-300mM、Tris-HCL15-25mM、EDTA0.2-1.0mM、甘油5-15％(体积分数)和NP400.01-0.08％(体积分数)，上述各原料的浓度均为终浓度，所述Tris-HCL的pH＝8.0；优选的，所述裂解液包括NaCL250mM、Tris-HCL20mM、EDTA0.5mM、甘油10％和NP400.05％。作为进一步优选的技术方案，所述核酸酶为全能核酸酶Benzonase，所述全能核酸酶Benzonase在Mg2+存在条件下，37℃消化溶液中残留的DNA和RNA；所述全能核酸酶Benzonase消化处理4h即可完全除去溶液中残留的DNA和RNA。由于纯化后的含有病毒样颗粒的样品溶液中还含有NP40等成分，若采用DNase和RNase对溶液中的DNA和RNA进行消化，消化的效率低，且不能完全去除DNA和RNA。本专利技术通过采用全能核酸酶Benzonase，可有效提高消化的速度，且可实现残余DNA和RNA的完全消化。作为进一步优选的技术方案，所述表达载体按照包括下述步骤的方法构建得到：(1)以噬菌体MS2RNA为模板，反转录得到cDNA，利用第一引物对进行扩增，得到包括MS2噬菌体外壳蛋白和PAC位点的第一PCR产物，利用NheⅠ和BamHⅠ对所述第一PCR产物以及携带有MS2噬菌体成熟酶A蛋白基因的重组载体pET28a/A分别双酶切，将PCR酶切产物与质粒酶切产物进行连接，得到第一重组质粒；(2)将所述S序列克隆在质粒pUC57中，得到pUC57/S质粒；(3)以所述pUC57/S质粒为模板，通过第二引物对扩增得到第二PCR产物，利用BamHⅠ和HindⅢ对所述第二PCR产物以及第一重组质粒分别进行双酶切，并连接酶切产物，得到第二重组质粒；所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述第一引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述第二引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的纯化方法采用如下技术方案：如上述任意一项所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的纯化方法，先向破碎后的、表达所述病毒样颗粒的重组菌体中加入硫酸铵对所述病毒样颗粒进行粗沉；再采用新型凝胶过滤介质CaptoTMCore700对粗沉得到的含有病毒样颗粒的样品进行精纯，即得纯化后的病毒样颗粒。CaptoTMCore700凝胶过滤层析介质由激活的配基核心和惰性壳层组成。惰性壳层可以排阻大分子(排阻分子量700kDa)，阻止其经壳层上的孔进入核心，穿柱的即为大分子蛋白，较小的杂质蛋白会与微球内在配基结合。与实验室或企业常用的凝胶层本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒含有MS2噬菌体外壳蛋白和包裹在所述外壳蛋白内部的重组基因S序列，所述S序列由依次相连的新型冠状病毒ORF1ab基因片段、人β-Globin基因片段、新型冠状病毒N基因片段和E基因片段组成；所述S序列具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒含有MS2噬菌体外壳蛋白和包裹在所述外壳蛋白内部的重组基因S序列，所述S序列由依次相连的新型冠状病毒ORF1ab基因片段、人β-Globin基因片段、新型冠状病毒N基因片段和E基因片段组成；所述S序列具有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒的制备包括下述步骤：(1)构建能够表达所述病毒样颗粒的表达载体，并将所述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌体；(2)诱导所述重组菌体，使其表达所述病毒样颗粒；(3)收集菌体，并加入裂解液，超声、破碎菌体以获取所述病毒样颗粒；(4)纯化所述病毒样颗粒；(5)采用核酸酶对经步骤(4)纯化所得的含有病毒样颗粒的溶液进行消化，以除去溶液中残留的DNA和RNA。


3.根据权利要求2所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述裂解液包括NaCL、Tris-HCL、EDTA、甘油和NP40；优选的，所述裂解液包括NaCL200-300mM、Tris-HCL20mM、EDTA0.2-1.0mM、甘油5-15％和NP400.01-0.08％，上述各原料的浓度均为终浓度，所述Tris-HCL的pH＝8.0；优选的，所述裂解液包括NaCL250mM、Tris-HCL20mM、EDTA0.5mM、甘油10％和NP400.05％。


4.根据权利要求2或3所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述核酸酶为全能核酸酶Benzonase，所述全能核酸酶Benzonase在Mg2+存在条件下，37℃消化溶液中残留的DNA和RNA；所述全能核酸酶Benzonase消化处理4h即可完全除去溶液中残留的DNA和RNA。


5.根据权利要求2所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述表达载体按照包括下述步骤的方法构建得到：(1)以噬菌体MS2RNA为模板，反转录得到cDNA，利用第一引物对进行扩增，得到包括MS2噬菌体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王云龙，王国强，李振勇，李玉林，孙新城，王继创，王敏，程蕾，王运从，
申请(专利权)人：河南省生物工程技术研究中心，
类型：发明
国别省市：河南;41