一种具有过氧化物酶活性的金铂纳米颗粒制备方法及在快速检测中的应用技术

本发明专利技术涉及具有过氧化物酶活性的金铂纳米颗粒制备方法及其应用，可有效解决酶联免疫技术中HRP偶联程序复杂，耗时长，稳定性差的问题，其解决的技术方案是，利用H2AuCl4通过柠檬酸钠还原法制备合适尺寸的Au纳米颗粒，然后，在此基础上通过化学原位还原方法在Au纳米颗粒表面包裹Pt原子层，本发明专利技术在最佳尺寸的胶体金颗粒的外层包裹铂原子层赋予其催化性能，从而替代传统天然酶，简化蛋白分子与金铂纳米酶偶联步骤，降低偶联过程的耗时，提高偶联物的稳定性；为了减少反复固液分离操作，引入磁性富集技术，简化了操作步骤，大大提升操作便捷性及现场检测的可能性，是金铂纳米颗粒的磁性富集可视化免疫检测方法上的创新。富集可视化免疫检测方法上的创新。富集可视化免疫检测方法上的创新。

【技术实现步骤摘要】
一种具有过氧化物酶活性的金铂纳米颗粒制备方法及在快速检测中的应用


[0001]本专利技术涉及检测
，特别是一种具有过氧化物酶活性的金铂纳米颗粒制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]酶联反应是免疫学分析中的重要技术手段，应用范围广、技术成熟。现有的较成熟的ELISA检测技术通过酶催化进行检测信号放大（如HRP、ALP等天然酶），即利用生物酶与生物分子偶联将抗原抗体特异性反应转化成颜色变化信号从而达到检测的目的，具有较高的灵敏度。这种通过生物酶催化实现信号转化的方式仍然存在亟待解决的弊端，天然酶因其固有结构属性在应用时容易受温度、酶抑制剂及湿度等的影响，制约了该试剂检测性能的发挥；且实验属于非均相反应，需要反复洗涤分离液体，操作复杂，影响因素众多。
[0003]另一方面，目前酶联免疫反应中的标记蛋白大多数使用的是过碘酸钠标记法，该偶联过程复杂且耗时长，使得相关检测试剂的生产成本大幅增长，由于大多数无机纳米催化剂对变色反应的信号转化效率比传统酶低，利用纳米催化剂标记进行比色免疫分析的信号放大仍然面临着巨大的挑战。因此，检测方法的改进和创新是目前亟需解决的问题。

技术实现思路

[0004]针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种基于金铂纳米颗粒的磁性富集可视化免疫检测方法，可有效解决酶联免疫技术中HRP偶联程序复杂，耗时长，稳定性差的问题。
[0005]本专利技术解决的技术方案是，一种金铂纳米颗粒的制备方法，首先，利用H2AuCl4通过柠檬酸钠还原法制备合适尺寸的Au纳米颗粒，然后，在此基础上通过化学原位还原方法在Au纳米颗粒表面包裹Pt原子层，具体包括以下步骤：1）将20ml的0.1%H2AuCl4加入含有180ml纯化水的250ml的圆底烧瓶中，并将其置于搅拌调温电热套上，加入一个磁力搅拌子并将溶液加热至沸腾，向沸腾的溶液中迅速加入3
‑
5.2ml的1%Na3C6H5O7·
2H2O（二水合柠檬酸三钠），当获得深红颜色的溶液时停止加热，进行胶体金纳米颗粒的粒径检测及电镜分析，通过调整Na3C6H5O7·
2H2O的加入量获得不同尺寸大小的Au纳米颗粒，考虑后续Pt原子层的包裹及蛋白分子的标记，选择制备出的40nm、60nm、80nm的金铂纳米颗粒进行后续优化条件；2）各取作为Pt前体的Na2PtCl6水溶液（1mmol/L）5ml、18ml、40ml分别加入到95ml、82ml、60ml含有柠檬酸溶液的40nm、60nm、80nm 金纳米颗粒溶液中，混匀，加热到80
°
C，然后将2ml的80mmol/L的L
‑
抗坏血酸通过微量注射泵缓慢加入上述混合溶液中，通过调整L
‑
抗坏血酸加入速率，最终获得金铂纳米酶颗粒。
[0006]所述的L
‑
抗坏血酸加入速率为0.6ml/h、1ml/h、1.4ml/h、1.8ml/h的一种。
[0007]经过上述Au纳米颗粒的粒径筛选及L
‑
抗坏血酸加入速率的优化，最终得到12种金
铂纳米颗粒。一方面，采用粒径及ZeTa电位分析对该颗粒进行物理特征分析；另一方面，用TMB+H2O2显色系统对其催化性能进行评价，确定最优选金铂纳米酶颗粒为1.4ml/h的速度加入80Mm的L
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抗坏血酸，还原Pt原子包裹在60nm Au的金铂纳米颗粒。
[0008]所述的步骤1）中制备的Au纳米颗粒粒径为60nm，PDI为0.402。
[0009]所述的步骤2）中制备的的金铂纳米酶颗粒粒径为64.8nm，PDI为0.377。
[0010]所述的最优选金铂纳米酶颗粒在新冠抗原可视化检测（双抗体夹心法）试剂中的应用。
[0011]所述的最优选金铂纳米颗粒的磁性富集可视化免疫检测方法，包括以下步骤：1）将筛选出的最优选金铂纳米酶颗粒应用到各种基于免疫学技术的病原体或基因工程亚单位抗原，如新冠抗原可视化检测（双抗体夹心法）试剂中，用0.02M碳酸钾溶液调节上述合成的1.0mL 金铂纳米酶颗粒混悬液的pH，然后将10μl的新冠N蛋白单克隆抗体（2.0mg/ml）加入上述金铂纳米酶颗粒混悬液中，并在恒温摇床中反应4h（4℃，200rpm）；取出离心(12000rpm，15min，4
°
C)，获得沉淀，加入封闭液，室温条件下在快速混匀器中反应2h，取出离心(12000rpm，15min，4
°
C)后倒掉上清，加入1ml稀释液中，存放于4℃备用；2）将金铂纳米颗粒催化性能与电磁棒磁力富集功能相结合，先将样本与相应的偶联磁微粒的捕获抗体（抗原）混合反应，再加入金铂纳米颗粒偶联抗体（抗原），反应后加入电磁棒通电产生磁性，若为阳性，则形成偶联磁微粒的捕获抗体（抗原）
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待检抗原（抗体）
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金铂纳米颗粒偶联抗体（抗原）三元复合物；然后将带有三元复合物的电磁棒转移到新的离心管中，加入显色液显色；若为阴性，则无法形成同时具有催化性能和磁性的三元复合物，加入显色液后无法显色；若采用竞争法，则用磁微粒偶联捕获抗体（抗原），金铂纳米颗粒标记竞争抗原（抗体），阴性显色，阳性不显色。
[0012]本专利技术在最佳尺寸的胶体金颗粒的外层包裹铂（Pt）原子层赋予其催化性能，从而替代传统天然酶，简化蛋白分子与金铂纳米酶偶联步骤，降低偶联过程的耗时，提高偶联物的稳定性；为了减少反复固液分离操作，引入磁性富集技术，简化了操作步骤，大大提升操作便捷性及现场检测的可能性，是金铂纳米颗粒的磁性富集可视化免疫检测方法上的创新。
附图说明
[0013]图1为本专利技术基于金铂纳米颗粒的磁性富集可视化免疫检测方法示意图。
[0014]图2为本专利技术不同条件下所得金铂纳米酶颗粒的催化性能；12种金铂纳米酶颗粒通过直接与等量显色系统反应，分析其催化速率。
[0015]图3为本专利技术金铂纳米颗粒
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N单抗与HRP
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N单抗的高温稳定性；对比分析金铂纳米颗粒
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N单抗与HRP
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N单抗耐高温的性能。
[0016]图4为本专利技术金铂纳米颗粒
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N单抗与HRP
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N单抗的HRP抑制剂稳定性；对比分析金铂纳米颗粒
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N单抗与HRP
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N单抗对HCl、NaCl、NaN3的抗性。
[0017]图5为本专利技术金铂纳米颗粒
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N单抗与HRP
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N单抗的加速稳定性；对比分析金铂纳米颗粒
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N单抗与HRP
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N单抗在37℃保存条件下其催化活性的变化。
具体实施方式
[0018]以下结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。
[0019]实施例1本专利技术在具体实施时，具体包括以下步骤：1）将20ml的0.1%H2AuCl4加入含有1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金铂纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将20ml的0.1%H2AuCl4加入含有180ml纯化水的250ml的圆底烧瓶中，并将其置于搅拌调温电热套上，加入一个磁力搅拌子并将溶液加热至沸腾，向沸腾的溶液中迅速加入3
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5.2ml的1%Na3C6H5O7·
2H2O，当获得深红颜色的溶液时停止加热，进行胶体金纳米颗粒的粒径检测及电镜分析，通过调整Na3C6H5O7·
2H2O的加入量获得不同尺寸大小的规则Au纳米颗粒，考虑后续Pt原子层的包裹及蛋白分子的标记，选择制备出的40nm、60nm、80nm的金铂纳米颗粒进行后续优化；2）在此基础上通过化学原位还原方法在金纳米颗粒表面包裹Pt原子层，各取作为Pt前体的1mmol/L的Na2PtCl6水溶液5ml、18ml、40ml分别加入到95ml、82ml、60ml含有柠檬酸溶液的40nm、60nm、80nm 金纳米颗粒溶液中，混匀，加热到80
°
C，然后将2ml的80mmol/L的L
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抗坏血酸通过微量注射泵缓慢加入上述混合溶液中，通过调整L
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抗坏血酸加入速率，最终获得金铂纳米酶颗粒。2.根据权利要求1所述的金铂纳米颗粒，其特征在于，所述的L
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抗坏血酸加入速率为0.6ml/h、1ml/h、1.4ml/h、1.8ml/h的一种。3.根据权利要求1所述的金铂纳米颗粒，其特征在于，所述的最优选金铂纳米酶颗粒为1....

【专利技术属性】
技术研发人员：王云龙，李登州，王继创，李玉林，程蕾，张怡青，
申请(专利权)人：河南省生物工程技术研究中心，
类型：发明
国别省市：