本发明专利技术公开了鸭干扰素α融合蛋白在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途，鸭干扰素α融合蛋白ELP‑DuIFNα是由类弹性蛋白多肽ELP和鸭干扰素α的蛋白氨基端融合得到的融合蛋白。表达的ELP‑DuIFNα安全无毒，半衰期长，在体内外均具有较强的抗病毒活性，可作为防治鸭病毒性肝炎的后备生物药物进一步研究。
【技术实现步骤摘要】
鸭干扰素α融合蛋白在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途
本专利技术属于兽药
，具体涉及一种鸭干扰素α融合蛋白对鸭1型肝炎病毒的抗病毒作用，从而制备抗鸭1型肝炎病毒的药物。
技术介绍
中国是世界水禽第一生产与消费大国，规模化鸭场近些年也在持续稳步增长，但是鸭的病毒性传染病却是困扰养鸭业的一大难题。鸭病毒性肝炎(DVH)是引起雏鸭致死的重要疫病之一，其病原为1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)，主要攻击4周龄以内的雏鸭，致死率可高达90％。免疫接种是防治DHAV-1感染的主要方法，但变异毒株的出现降低了免疫效率甚至导致免疫失败，因此急需寻找防制DVH的新方法。干扰素(Interferon,IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能的糖蛋白，主要有I型和II型，IFN-α属于Ⅰ型干扰素，其抗病毒活性在整个干扰素家族中最为突出。鸭IFN-α(DuckAlphaInterferon，DuIFNα)首次于1995年由Schultz等成功克隆，随后，相继有学者克隆出了不同品种鸭的IFN-α基因。但是天然DuIFN-α来源有限、重组干扰素也存在表达量低、纯化难、半衰期短、活性低等缺点，尤其是半衰期短这一缺点，限制了DuIFNα的后续开发。聚乙二醇(PEG)法和人血清白蛋白(HSA)结合法，这两种延长半衰期的方法已被用于重组人IFN的制备并在临床得以应用。但是，聚乙二醇化存在效率低、临床疗效差、副作用明显等缺点，人血清白蛋白(HSA)结合法虽然疗效好、副作用小，但是价格昂贵。如何降低DuIFN-α的纯化难度、延长DuIFN-α的半衰期并提高其功效是本领域技术人员需要解决的技术问题。类弹性蛋白多肽(Elastin-likepolypeptide，ELP)是一类根据体内弹性蛋白重复序列合成的五肽聚合物，具有温度敏感的可逆相变特性，外加其免疫原性低、生物相容性好而常被用于蛋白纯化和药物传递。因此，本专利技术将ELP应用于DuIFNα的纯化和半衰期延长，开展ELP-DuIFNα对DHAV-1抗病毒作用研究。
技术实现思路
针对
技术介绍
提出的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα及其应用。本专利技术的另一目的在于提供一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα表达载体。本专利技术的另一目的在于提供一种密码子优化的鸭干扰素α基因。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα，它是由类弹性蛋白多肽ELP和鸭干扰素α的蛋白氨基端融合得到的融合蛋白。上述的鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα的制备方法为：依据大肠杆菌密码子的偏好性合成如SEQIDNO：1所示的DuIFNα基因并在两端引入XhoI和SacI，合成的DuIFNα经XhoI和SacI双酶切，与同样经XhoI和SacI双酶切的pET30a-ELP载体连接后筛选得到重组载体pET30a-ELP-DuIFNα，将重组载体pET30a-ELP-DuIFNα转化感受态表达菌株获得表达工程菌，并进行诱导表达、纯化蛋白、去除内毒素得到融合蛋白ELP-DuIFNα。所述的表达菌株为BL21。一种密码子优化的鸭干扰素α基因，其具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα表达载体，该表达载体的构建方法为：依据大肠杆菌密码子的偏好性合成如SEQIDNO：1所示的DuIFNα基因并在两端引入XhoI和SacI，合成的DuIFNα经XhoI和SacI双酶切，与同样经XhoI和SacI双酶切的pET30a-ELP载体连接后筛选得到重组载体pET30a-ELP-DuIFNα。含有上述鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα表达载体的转基因细胞系或表达工程菌。上述的鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα在制备防治鸭病毒性肝炎药物中的用途。上述的鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα在制备抗鸭1型肝炎病毒的药物中的用途。上述药物的给药方式优选为灌服给药。本研究将DuIFN-α与ELP融合表达，旨在借助ELP能作为体内药物传送载体，克服鸭α-干扰素分子量较小，容易被蛋白酶降解和肾脏排出，体内半衰期短，不能发挥持久疗效的缺点，以达到稳定并缓释蛋白，延长ELP-DuIFNα半衰期，减少用药次数，降低应用成本的目的。从研究结果看，重组DuIFN-α在小鼠和雏鸭血浆中的半衰期均长于以往报道的12-25h，约为48h，在雏鸭体内半衰期可以达到60h，每48h给予一次干扰素即可有效保护动物免受病毒的攻击。重组ELP-DuIFNα可在细胞上表现出较高的抗病毒活性；在体内，可延缓发病时间，保护雏鸭免受DHAV-1感染，保护率可达到80％；而胚体回归试验及多重PCR检测结果，则进一步证实了重组ELP-DuIFNα对病毒的高效抑制作用。这一研究结果为重组鸭干扰素制剂研发，预防鸭其他疫病，降低养鸭业经济损失奠定了基础。本专利技术的有益效果：本专利技术的融合蛋白ELP-DuIFNα安全无毒，半衰期长，在体内外均具有较强的抗病毒活性，可作为防治鸭病毒性肝炎的后备生物药物进一步研究。附图说明图1为ELP与DuIFNα不同融合顺序的结果。图2为纯化后ELP-DuIFNα的SDS-PAGE鉴定。其中，M：ProteinMarker；1：纯化的ELP-DuIFNα。图3为未插入ELP的pET30a-DuIFNα载体的表达结果。其中，M：ProteinMarker；1：pET30a-DuIFNα上清；2：pET30a-DuIFNα沉淀；3：pET30a空载体对照。图4为ELP-DuIFNα的体外半衰期分析图。图5为ELP-DuIFNα在鸭体内的半衰期分析图。图6为肝脏对比图。图7为胚体及肝脏比对图。图8为多重PCR鉴定结果图。其中，M:1kbDNALadder；1-7:分别为试验组编号对应的尿囊液；8:已知DHAV-1；9:生理盐水。具体实施方式以下通过具体试验例对本专利技术进行进一步解释说明：实施例11.材料与方法1.1主要试剂限制性内切酶XhoI和SacI、T4DNA连接酶、1kbDNAMarker购自Fermentas公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、ViralRNA/DNAExtractionKit均购自TaKaRa公司；预染Protein分子量Marker购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DMEM培养基、FM培养基、胰酶、胎牛血清购自ThermoFisherScientific公司；MTS检测试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒、SDSPAGE凝胶电泳试剂盒、Tris-Gly电泳缓冲液购自康为世纪有限公司。1.2主要生物材料及试验动物DH5α、BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞购自康为世纪公司；如SEQIDNO：1所示的DuIFNα基因由生工生本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα，其特征在于，它是由类弹性蛋白多肽ELP和鸭干扰素α的蛋白氨基端融合得到的融合蛋白。/n
【技术特征摘要】
1.一种鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα，其特征在于，它是由类弹性蛋白多肽ELP和鸭干扰素α的蛋白氨基端融合得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的鸭干扰素α融合蛋白ELP-DuIFNα，其特征在于，所述融合蛋白的制备方法为：依据大肠杆菌密码子的偏好性合成如SEQIDNO：1所示的DuIFNα基因并在两端引入XhoI和SacI，合成的DuIFNα经XhoI和SacI双酶切，与同样经XhoI和SacI双酶切的pET30a-ELP载体连接后筛选得到重组载体pET30a-ELP-DuIFNα，将重组载体pET30a-ELP-DuIFNα转化感受态表达菌株获得表达工程菌，并进行诱导表达、纯化蛋白、去除内毒素得到融合蛋白ELP-DuIFNα。
3.一种密码子优化的鸭干扰素α基因，其具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
4.一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：王永娟，朱善元，郭艳丽，郭长明，洪伟鸣，吴植，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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