紫杉醇类药物疗效预测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术和临床医学检验领域，公开了一种检测β微管蛋白Ⅲ（βｔｕｂｕｌｉｎⅢ）在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒，该试剂盒可以用来有效筛选对紫杉类药物治疗有效的恶性肿瘤患者。

【技术实现步骤摘要】
紫杉醇类药物 t效预测试剂盒及其应用本专利技术涉及一种检测人e —微管蛋白in在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒，以此在临床 上预测对紫杉类治疗疗效好的患者。属于生物技术和临床医学检验领域。肺癌的发病率及病死率在我国均有逐年上升的趋势，根据病理学的分型，确诊的肺癌中约有80%为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer NSCLC)，在每年新诊断的NSCLC中， 大部分患者的病程已到晚期而无法行手术治疗，化疗及放疗是针对这部分患者的主要治疗方 法，而化疗耐药是晚期患者治疗失败和死亡的主要原因。导致临床化疗耐药的原因有药代 动力学因素，肿瘤微环境因素，肿瘤细胞特异性因素等。在化疗方案与给药剂量相同的情况 下，不同个体对化疗的敏感性有很大的差异，这种差异使传统依靠经验进行化疗面临极大的 挑战，因此迫切需要一种能够预测化疗疗效的方法，为对患者进行个体化治疗提供依据。紫衫醇类药物，是目前临床治疗NSCLC的常用药物。紫杉醇属细胞毒类化合物， 为一抗微管药物。促使微管蛋白二聚体装配成微管，并阻止其解聚而稳定微管,从而抑制了细胞 的有丝分裂起到了抗肿瘤作用,但不影响DNA、 RNA和蛋白质的合成。微管是真核细胞的一种组成成份，它是由两条类似多肽(a和e)亚单位构成的微管蛋白二聚体形成的。正常情况下，微管和微管蛋白二聚体之间存在动态平衡，紫杉醇可使两者之间失去动态平衡，诱导 和促进微管蛋白聚合防止解聚，稳定微管，这些作用导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体 和纺锤丝，抑制了细胞分裂和增殖，从而发挥抗肿瘤作用。体外研究表明，紫杉醇浓度依赖 性地、可逆性地结合到微管上，尤其是结合到N端微管蛋白的13-亚单位上，这一作用降低了 聚合所需要微管蛋白的浓度，使动态平衡向着微管装配的方向移动，增加聚合的速率和产量。 另外紫杉醇抑制有丝分裂所必需的微管网的正常动态再生，会防止正常的有丝分裂纺锤体的 形成，导致染色体断裂并抑制细胞复制和移行。紫杉醇改变了细胞的有丝分裂过程，使有丝 分裂持续时间从0.5h增加到15h，并抑fij细胞质分裂。目前紫杉醇类药物包括特素,泰素，安泰素，泰索帝,紫杉特尔，艾素等，主要应用于肺癌、 乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、转移性肾癌以及头颈部肿瘤的化疗。3研究表明e微管蛋白m(e t u b u i i nin)的过表达影响患者对紫杉类药物的敏感性。编码e t u b u 1 i n的基因定位于.6p21.3,有4个外显子,第4外显子是最重要的,不 仅是主要编码区，而且是e t u b u 1 i n与GTP和紫杉类药物作用的位点，经常发生突 变。0 t u b u 1 i n有7种异构体，V e r d i e r P i n a r d等用等电点聚焦和质谱 仪联合检测发现,在7种异构体中只有e t u b u 1 i nIII才是微管作用药物耐药的惟一标 志物。H a r i等将e t u b u 1 i nlllc D N A转染至哺乳动物细胞系，表达有P t u b u 1 i nIII蛋白的细胞显示出对紫杉醇耐药。R o s e 1 1等甩定量P C R法检测75例N S C L C石蜡组织中e t u b u I i nIIImR N A的表达，研究发现低e t u b u 1 i n III表达的患者对紫杉醇敏感性高，疗效好，同时，e t u b u 1 i nIII表达与病情进展密切相关。因此，肺癌患者治疗前通过检测p t u b u 1 i nffl等相关基因有助于指导化疗方案的 选择及预测疗效。0 t u b u 1 i nIII的低表达是晚期N S C L C接受紫衫醇类化疗的一个 预见性指标。这一结果告诉我们可通过检测P t u b u 1 i nIII的表达水平，指导选择是否 含紫衫醇类的方案治疗以及预测紫衫醇类药物的疗效，从而使病人真正接受个体化治疗，这 也将为术前术后化疗方案的选择提供有利的依据。荧光定量PCR技术是当前检测基因表达水平的较精确的方法之一，技术成熟规范适合于 临床标准化的检测，对于活组织切除，纤支镜检查及手术中取得的肿瘤组织标本均可进行检 测。其检测结果将有益地指导晚期及术后的非小细胞肺癌患者的治疗。本专利技术的目的在于应用Rea1-TimePCR技术，设计出一种检测人在肿瘤组织中P—微管蛋白III 的表达水平的试剂盒。该试剂盒包括Trizol、 RT-PCR逆转录试剂、T-载体连接试剂、荧光 定量PCR试剂、引物、TAQ酶、标准品。其中RT-PCR检测试剂特征是oligo(dT)2() ， dNTPmix， DEPC-treated water, 10XRT buffer, MgCl2， DTT， RNASEOUT ， Superscript III RT。 T-载体连接试剂特征是2X Rapid Ligation Buffer, pGEM-T Vector, T4DNA连接酶。荧光 实时定量RT-PCR检测人肿瘤组织ERCC1试剂特征是SYBRPremix ExTaq(2X)， Rox reference dye。目标基因P t u b u 1 i nIII上下游引物分别是 forward: 5，- GCGAGATGTACGAAGACGAC -3' reverse: 5，- TTTAGACACTGCTGGCTTCG -3，；校正基因Beta-Actin上下游引物分别是 forward: 5，-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3' reverse: 5，-CATCACGATGCCAGTGGTA-3';目标基因ERCC1标准品序列为校正基因Beta-Actin标准品序列为GTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。该试剂盒采用SYBR Green嵌合荧光法进行Real-Time PCR对临床能取得肿瘤组织的患者 进行检测；检测方法筒单可行，检测结果稳定可靠，.具有髙特异性、高灵敏度的特点，而且 非常适于批量样本检测，可以用来筛选对紫杉类治疗有效的晚期或术后非小细胞肺癌患者。附图说明图1是e-actin标准曲线； 图2是e-actin标准品扩增曲线； 图3是P-tubulin标准曲线; 图4是P -tubulin标准品扩增曲线。 实施例1、一组织RNA的提取1. 新鲜组织取下后，立即置于液氮中，然后存于一8(T C冰箱中保存待检测。2. 取适当大小组织标本(约100毫克)用研铂在液氮中磨碎，移入装有1000ulTrizo1的 预冷的1. 5毫升离心管中，冰上放置10分钟。3. 加入200ul的氯仿。4. 用镊子取子弹头，盖上盖子，上下颠倒混匀，15S左右。5. 静置5miru6. 离心，12000RPM/min, 4°C， 15min。7. 取上层。(中下层为蛋白质和DNA的混合物)8. 加入异丙醇:1000ml Trizol加入500ul异丙醇.9. 混匀，静置10min。离心，12000RPM/min， 4°C， 15min。10. 直接将上清液弃掉，可以看见壁上有少许白色沉淀黏附。11. 75%酒精洗涤加入量与Trizol—样。混匀。离心，8000g/min, 4。C, 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种紫杉醇类药物疗效预测试剂盒，它包括：Ｔｒｉｚｏｌ、ＲＴ－ＰＣＲ逆转录试剂、Ｔ－载体连接试剂、荧光定量ＰＣＲ试剂、引物、ＴＡＱ酶、标准品，其特征在于：　目标基因β　ｔ　ｕ　ｂ　ｕ　ｌ　ｉ　ｎ　Ⅲ上下游引物分别是：ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＧＣＧＡＧＡＴＧＴＡＣＧＡＡＧＡＣＧＡＣ－３’　ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＧ－３’；　校正基因Ｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ上下游引物分别是：　ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡ－３’　ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＣＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＣＡＧＴＧＧＴＡ－３’；　目标基因ＥＲＣＣ１标准品序列为：　ＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＴＡＧＴＣＧＧＧＡＡＴＴＡＣＧＴＣＧＣＣＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＣＧＡＡＣＴＴＣＡＧＴＡＣＧＧＧＡＴＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＴＴＧＣＣ；　校正基因Ｂｅｔａ－Ａｃｔｉｎ标准品序列为：　ＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＧＴＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＣＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴一龙，陈志红，郭爱林，张绪超，林嘉颖，谢至，陈世良，董嵩，聂强，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]