用双-二阳离子芳基呋喃荧光检测核酸及细胞骨架成分的方法技术

本发明专利技术公开了一种荧光检测核酸的方法。该方法包括将该核酸和双－二阳离子芳基呋喃化合物如：２，５－双［４－（４，５，６，７－四氢－１Ｈ－１，３－二氮杂卓－２－基）苯基］呋喃；２，５－双｛［４－（Ｎ－异丙基）脒基］苯基｝呋喃及其生理上可接受的盐相接触，然后将该核酸暴露于一定频率的光中以诱发该化合物的荧光。本发明专利技术还公开了一种荧光检测细胞骨架成分的方法以及新的双－二阳离子芳基呋喃化合物。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是在来自国家健康研究所的编号为U01-AI-3363的政府资助下完成的。政府对本专利技术持有某些权利。本专利技术涉及结合并检测核酸和细胞骨架成分的方法。更具体地说，本专利技术涉及使用双-二阳离子芳基呋喃化合物荧光检测核酸和细胞骨架成分的方法。很多种样品的分析依赖于一种染料的荧光特性。当一个分子被一定波长的光激发后回复到非激发态(稳定态)而放射出波长更长的光时便产生了荧光。激发光和发射光由于波长不同，可用滤光器彼此区分开来。荧光已通过光学显微术被应用于观测某些分子(及其结构)很多年了，它也应用于诸如流式血细胞计数等其它分析技术。在荧光分析中使用的荧光探针可分为两大类，即那些共价标记其它探针(通常为抗体)的探针以及那些其分布或荧光反映出它们的环境和细胞特定特征的探针。在后一类中，那些特异性地结合于核酸或细胞骨架结构或组分的荧光化合物特别重要。已知各种各样的荧光探针，例如丙锭和乙锭类染料已被应用。然而，这些化合物和脱氧核糖核酸(DNA)以及双链核糖核酸(RNA)都能结合。因此，如果要检测DNA，那么必需除去RNA。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)也作为DNA染料广泛地应用于细胞学，核酸的生物物理分析以及流式血细胞计数。DAPI优选结合于富含AT的DNA序列小沟，但它也嵌入GC和混杂GC/AT的序列，更重要的是它还和RNA结合。W.D.Wilson，等人，“The Effects of Ligand Structure on Binding Mode of Unfused Aro-matic Cations with DNA”in Molecular Basis of Specificity in NucleicAcid-Drug Interactions，Klumar Academic Publishers，Amsterdam(1990)，pps.331-353；W.D.Wilson，等人，Biochemistry 32，4098-4104(1993)。DAPI也和诸如微管蛋白等其它细胞组分结合，导致RNA及微管蛋白被染色。过去已经合成许多芳基联脒用作抗原生生物制剂，B.P.Das andD.W.Boykin，J.Med，Chem.20，531-536(1977)。象DAPI一样，2，5-双(4-脒基苯基)呋喃也优选结合于富含AT的DNA序列中的DNA小沟，但也相互作用于GC和混杂GC/AT序列，W.D.Wilson，等人.(1990)，Supra；W.D.Wilson，等人(1993)，Supra。另一个应用于荧光分析的染料是双-苯酰亚胺Hoechst 33258。Loontiens等提出，作为一紧密相关的分子，Hoechst 33258在DNA序列大沟中通过自缔合复合物与富含GC的序列结合。F.G.Loon-tiens，et al，Biochemistry29，9029-9039(1990)。此染料也和RNA有明显的结合。Wilson，et al.(1993)，Supra。因此，同DAPI以及2，5-双(4-脒基苯基)呋喃一样，Hoechst 33258也会与非DNA成分明显染色。首先，本专利技术提供了一个如式(I)所示的新化合物 其中R1和R2各自独立选自H，低级烷基，环烷基，芳基，羟基烷基，氨基烷基或者烷基氨基烷基，或者R1和R2共同代表一个C2到C10的亚烷基或R1和R2一起为 其中n是从1到3的数字，R10是H或者-CONHR11NR15R16，其中R15和R16是各自独立选自H和低级烷基；R3是H，低级烷基，环烷基，芳基，羟基烷基，氨基烷基或者烷基氨基烷基；A是杂环芳基团，选自如下一组基团 其中R4，R5和R6各自独立选自H，低级烷基，卤素，氧烷基，氧芳基，或者氧芳基烷基；R12是H，低级烷基，羟基，氨基烷基或者烷基氨基烷基。本专利技术一个优选的实施方案中，R1和R2一起为 其中n是从1到3的数字，R10是H或者-CONHR11NR15R16，其中R15和R16各自独立选自H和低级烷基；并且R3，R4和R5每一个是H。在本专利技术另一个优选实施方案中，R1，R3，R4和R5为H，而R2则为低级烷基。本专利技术的第二个方面是荧光检测核酸的方法。此方法包括，将根据式(I)的化合物与核酸相接触，且暴露核酸于光中以诱发式(I)化合物的荧光。本专利技术的第三方面是在含有DNA和RNA的核酸混合物中选择性地对DNA进行荧光检测的方法。此方法包括步骤(a)将根据式(I)的化合物与核酸混合物相接触；步骤(b)暴露核酸混合物于光中以诱发式(I)化合物的荧光。本专利技术的另一方面是荧光检测微管结构的方法。此方法包括，将根据式(I)的化合物与微管结构相接触，且暴露微管结构于光中以诱发式(I)化合物的荧光。本专利技术还有一个方面就是在一细胞中同时荧光检测第一细胞结构和第二细胞结构的方法，这里所说的第一细胞结构和第二细胞结构是不同的。此方法包括(a)将细胞与第一荧光化合物及第二荧光化合物相接触。第一荧光化合物和第二荧光化合物彼此存在着结构上的不同，但每一荧光化合物都有根据式(I)的结构。第一荧光化合物选择性地结合于第一结构，而第二化合物则选择性地结合于第二结构。并且，第一和第二荧光化合物具有不同的荧光发射光谱。当细胞与第一和第二荧光化合物接触后，(b)将细胞暴露于光中以诱发第一和第二荧光化合物的荧光，从而使第一细胞结构和第二细胞结构以不同的荧光发射光谱发射荧光。本专利技术还有另一方面，是为荧光检测细胞结构而提供的试剂盒。试剂盒包括(a)根据式(I)的化合物，(b)一种充足量的溶剂，以便当化合物和含有核酸的样品相接触时能形成被式(I)的化合物标记的核酸的混合物。本专利技术进一步的方面是包括含有式(I)，(Ia)或(Ib)化合物或其生理上可接受的盐作为试剂盒中的成分的试剂盒。对本专利技术上述的以及其它的目的和方面在下面叙述中有详细解释。这里公开了在荧光检测核酸方法中有用的化合物。该化合物包括如下式(I)所示的化合物 R1和R2各自独立选自H，低级烷基，环烷基，芳基，羟基烷基，氨基烷基或烷基氧基烷基或者R1和R2一起为直链或支链、饱和或不饱和的C2至C10亚烷基，或者R1和R2一起为 其中n是从1到3的数字，R10是H或者-CONHR11NR15R16，这里的R15和R16各自独立选自H和低级烷基。优选地，R10是H。R10可以位于环中C-2，C-3，C-4或C-5的任何位置。优选地，R10位于C-3位置。本专利技术一个优选的实施方案中，R1和R2一起为 这里的n和R10如上所述。在另一优选实施方案中，R1和R2一同代表C2到C10的直链饱和亚烷基。更优选地，R1和R2一同代表C2到C5的直链饱和亚烷基。在本专利技术再一优选实施方案中，R1为H，而R2则为低级烷基，优选异丙基。R3可选自H，低级烷基，环烷基，芳基，氨基烷基或烷基氨基烷基。优选地，R3是H或如式-R14OH的烷基羟基，这里的R14为低级烷基。优选地，R14为-(CH2)2-。A为从如下一组基团中选择的杂环芳基 前述的代表A的基团可被R4和R5邻、间、对位取代。R4可选自H，低级烷基，卤素，氧烷基，氧芳基或氧芳基烷基。优选R4为H或者低级烷基。R5可选自H，低级烷基，卤素，氧烷基本文档来自技高网...

【技术保护点】
荧光检测核酸的方法，包括：（ａ）将所述的核酸与按照式（Ⅰ）的化合物或其生理上可接受的盐接触＊＊＊ （Ⅰ）这里：Ｒ↓［１］和Ｒ↓［２］各自独立选自Ｈ，低级烷基，环烷基，芳基，羟基烷基，氨基烷基或烷基氨基烷基；或者Ｒ↓［１］和Ｒ ↓［２］一同代表Ｃ↓［２］到Ｃ↓［１０］的亚烷基；或者Ｒ↓［１］和Ｒ↓［２］一同为＊＊＊这里的ｎ是从１到３的数字而Ｒ↓［１０］是Ｈ或者－ＣＯＮＨＲ↓［１１］ＮＲ↓［１５］Ｒ↓［１６］，其中Ｒ↓［１１］是低级烷基，而Ｒ↓［１５］和 Ｒ↓［１６］则各自独立选自Ｈ和低级烷基；Ｒ↓［３］是Ｈ，低级烷基，环烷基，芳基，羟基烷基，氨基烷基或者烷基氨基烷基；并且Ａ是从如下一组基团中选择的一个杂环芳基：＊＊＊这里的Ｒ↓［４］，Ｒ↓［５］及Ｒ↓［６］各自独立选自Ｈ，低 级烷基，卤素，氧烷基、氧芳基、或氧芳基烷基；Ｒ↓［１２］是氢，低级烷基，羟基，氨基烷基或烷基氨基烷基；（ｂ）暴露所述的核酸于光中以诱发所述的式（Ⅰ）化合物的荧光。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：CC戴斯特拉，RR狄维尔，DW伯肯，WD维尔逊，J司派查拉，BP戴斯，A库玛尔，
申请(专利权)人：查珀尔希尔北卡罗来纳大学，佐治亚州立大学研究基金会公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]