用于增加收集的镜像显微术制造技术

用于使用荧光显微术对样本进行成像的方法、用于使用荧光显微术对样本进行成像的系统以及用于荧光显微镜的照明系统。在一些示例中，一种方法包括在样本周围定位双凸抛物面镜包体。双凸抛物面镜包体包括彼此反平行定向的上抛物面镜和下抛物面镜。在下抛物面镜中限定孔，半球形圆顶被安装在该孔中，样本被半球形圆顶包围。该方法包括将激发光引导到样本上，以在上抛物面镜的上顶点处形成初级图像，并在下抛物面镜的下顶点处形成次级图像。该方法包括通过显微镜的检测物镜对样本进行成像。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增加收集的镜像显微术政府利益本专利技术是在美国国家科学基金会资助的授权号MCB-1652512的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。优先权声明本申请要求于2018年3月12日提交的美国临时专利申请序列号62/641533的权益，其全部内容通过引用合并于此。
本说明书总体涉及荧光显微镜，并且更具体地涉及用于增加收集的镜像显微术。
技术介绍
活细胞荧光显微术依赖于生物样本内部的激发荧光分子、捕获从荧光团发出的光子、并重新聚焦所发出的光子以重新创建样本的放大图像。图1示出了用于样本102的荧光显微术的示例系统100。系统100包括显微镜的检测物镜104。样本102根据检测物镜104被安放。被引导到样本上的激发光的量超出从样本收集的发射荧光的量几个数量级。因此，捕获最大数量的光子对于荧光显微术至关重要，因为收集的光子数量与图像质量和图像分辨率均直接成正比。荧光显微术依靠Snell折射定律弯曲发射的荧光光子，通常通过弯曲的玻璃透镜。最终，折射对于捕获和重新聚焦荧光不是理想的，这有两个原因：色差和收集效率。现代物镜类型的透镜元件已针对色差被强力校正，但从理论上讲折射是不可避免的。另外，从理论上讲，透镜物镜只能收集从荧光点源发出的所有光子的一半。由于全内反射的实际限制，从单个物镜的收集效率被限制在40％左右。由于发射的光子是图像采集的限制因素，这种检测效率不足给细胞生物学家带来了问题。图2是示出由于未收集到光子而导致的检测效率不足的图。多重物镜(例如4Pi显微术(1))提高了光学系统的整体收集效率，但由单个透镜物镜收集的光子数量保持不变。另外，多重透镜物镜使检测路径复杂化，因为两个物镜都产生同一样本的单独图像。
技术实现思路
本说明书描述了一种用于在理论上使任何现有荧光显微镜的收集效率加倍而又不使原始检测路径复杂化或引入色差的系统。在一些示例中，一种方法包括在样本周围定位双凸抛物面镜包体。双凸抛物面镜包体包括彼此反平行定向的上抛物面镜和下抛物面镜。在下抛物面反射镜中限定孔，半球形圆顶被安装在该孔中，并且样本被半球形圆顶包围。该方法包括将激发光引导到样本上，以在上抛物面镜的上顶点处形成初级图像，并在下抛物面镜的下顶点处形成次级图像。该方法包括通过显微镜的检测物镜对样本进行成像。附图说明图1示出了用于样本的荧光显微术的示例系统；图2是示出由于未收集到光子而导致的检测效率不足的图；图3是示出用于使用荧光显微术对样本进行成像的示例系统的图；图4是示出在顶点平面上与样本重叠的图像的图；图5是示出重叠的次级图像的图；图6是示出与透镜型物镜元件组合的光学设置的图；图7示出了对双抛物面布置的替代修改；图8示出了独特的几何形状创建了被反转的对象图像；图9示出了平面镜替换的潜在用途；以及图10是用于使用荧光显微术对样本进行成像的示例方法的流程图。具体实施方式本说明书描述了用于使用荧光显微术对样本进行成像的方法、用于使用荧光显微术对样本进行成像的系统以及用于荧光显微术的照明系统。该系统可以称为MIMIC：用于增加收集的镜像显微术。图3是示出用于使用荧光显微术对样本102进行成像的示例系统的图。该系统包括被定位在样本102周围的双凸抛物面镜包体300。双凸抛物面镜包体300包括彼此反平行定向的上抛物面镜302和下抛物面镜304。在下抛物面镜304中限定孔306，半球形圆顶308被安装在孔306中，并且样本102被半球形圆顶308包围。该系统还包括照明系统310，照明系统310被配置用于将激发光引导到样本102上以在上抛物面镜302的上顶点处形成初级图像，并且在下抛物面镜304的下顶点处形成次级图像。在一些示例中，照明系统310被配置用于通过检测物镜(例如图1的检测对象104)对样本进行成像。图3显示了负责提高收集效率的辅助光学元件。该光学元件是双凸抛物面镜包体，其抛物面镜的方向彼此反平行。此外，两个抛物面的焦距和较大开口均相同。每个抛物面的焦点位于另一抛物面的顶点。因此，每个抛物面的高度应为焦距的一半，使得抛物面可以被安装在彼此的顶部上，而在物理上不重叠。下抛物面具有以其顶点为中心的孔，半球形玻璃圆顶安装在该孔中。圆顶是透明的且以下抛物面的顶点为中心。圆顶可由任何合适的材料形成，例如玻璃或塑料或诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)之类的聚合物。圆顶的厚度均匀，从而它可以提供从顶点到上抛物面的透明、不聚焦的窗口。最后，半球形圆顶在其顶部有一个小孔，以便可以在圆顶中填充适合活样本的液体介质。前述几何形状的目的是下抛物面的顶点平面与上抛物面的顶点光学共轭。因此，从下顶点附近或下顶点处的点发射的光子被上抛物面镜收集并准直。接下来，准直的光子被下抛物面重新聚焦，以在上抛物面的顶点处形成初级图像。接下来，光子被下抛物面重新准直。最终，光子在下顶点处或附近重新聚焦到次级图像。在光学上，所形成的次级图像在横向(XY)维度上是正立的，而在轴向(Z)维度上则是倒立的，如绿色/品红色样本和图像所示。因此，随着样本移近顶点平面，图像开始在顶点平面与样本重叠。图4是示出图像在顶点平面处与样本重叠的图。因此，样本的与下顶点共面的任何平面都被其自身的次级图像重叠。图5是示出重叠的次级图像的图。当与透镜型物镜元件组合时，这种光学设置的意义在于，从焦平面发射远离检测物镜的光子被收集，并从相同角度重新聚焦到样本内部的相同空间位置。图6是示出与透镜型物镜元件组合的光学设置的图。因此，检测物镜焦平面应与下抛物面顶点共面，以使对焦信号最大化。由于次级图像在横向上是正立的，因此光子携带的空间信息与直接发射到检测物镜中的空间信息相同。因此，这些重新聚焦的光子能够被检测物镜收集。因而，由检测物镜形成的任何图像将由两倍于正常数量的光子形成，从而有效地使图像的亮度加倍(取决于圆顶的直径)。双抛物面镜系统的重新聚焦性质与其绝对尺寸无关，这意味着镜面可以缩放到几乎任何尺寸，并且仍然可以正常工作。在任何尺寸，抛物面系统都将接受以约～70.5°的半角从检测物镜发射出的光子。因此，重新聚焦的光的最大半角也是约～70.5°。接受角小于70.5°的检测物镜将无法收集所有重新聚焦的光，但将经历比其原始图像更大的相对亮度增加。接受角大于70.5°的物镜可以收集所有重新聚焦的光，但将经历更小的相对亮度增加。另外，应考虑半球形圆顶的相对尺寸和绝对尺寸。如果圆顶太小，则球面像差(来自圆顶)可忽略不计的视场尺寸将减小。然而，圆顶越大，下抛物面的反射面积越小，这意味着中心圆顶对重新聚焦的光的遮挡越大。图7示出了对MICIC的双抛物面布置的替代修改。代替抛物面上镜面，替换为平面上镜面。图7中所示的替代系统可以称为MIMICp系统，其中“p”表示平面上镜面。图8示出了独特的几何形状创建对象的图像，该图像关于下抛物面镜的顶点在X、Y和Z维度上反转。如果对象从顶点在X和Y中移位，则图像将不会与对象重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于使用荧光显微术对样本进行成像的方法，所述方法包括：/n在所述样本周围定位双凸抛物面镜包体，所述双凸抛物面镜包体包括彼此反平行定向的上抛物面镜和下抛物面镜，其中在所述下抛物面镜中限定孔，半球形圆顶被安装在所述孔中，并且所述样本被所述半球形圆顶包围；/n将激发光引导到所述样本上，以在所述上抛物面镜的上顶点形成初级图像，并且在所述下抛物面镜的下顶点处形成次级图像；以及/n通过显微镜的检测物镜对所述样本进行成像。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180312 US 62/641,5331.一种用于使用荧光显微术对样本进行成像的方法，所述方法包括：
在所述样本周围定位双凸抛物面镜包体，所述双凸抛物面镜包体包括彼此反平行定向的上抛物面镜和下抛物面镜，其中在所述下抛物面镜中限定孔，半球形圆顶被安装在所述孔中，并且所述样本被所述半球形圆顶包围；
将激发光引导到所述样本上，以在所述上抛物面镜的上顶点形成初级图像，并且在所述下抛物面镜的下顶点处形成次级图像；以及
通过显微镜的检测物镜对所述样本进行成像。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述半球形圆顶是光学透明的，并且以所述下抛物面镜的下顶点为中心。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述半球形圆顶由玻璃形成并且具有均匀的厚度，其中，在所述半球形圆顶的顶部中限定圆顶孔，并且其中，对所述双凸抛物面镜包体进行定向包括通过所述圆顶孔以液体介质填充所述圆顶。


4.根据权利要求1所述的方法，其中，定位所述双凸抛物面镜包体包括：定位所述样本和所述双凸抛物面镜包体，使得所述样本的受关注平面与所述下抛物镜的下顶点共面，导致所述样本的受关注平面与所述次级图像重叠。


5.根据权利要求1所述的方法，其中，定位所述双凸抛物面镜包体包括：定位所述双凸抛物面镜包体，使得所述检测物镜的焦平面与所述下抛物镜的下顶点共面，并且其中，所述次级图像被形成为在显微镜的横向(XY)维度上正立并且在显微镜的轴向(Z)维度上倒立。


6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述上抛物面镜的上焦距等于所述下抛物面镜的下焦距，其中，所述上抛物面镜的上焦点位于所述下抛物面的下顶点处，并且所述下抛物面镜的下焦点位于所述上抛物面镜的上顶点处，并且其中所述上抛物面镜的上高度是所述上焦距的一半，并且所述下抛物面镜的下高度是所述下焦距的一半。


7.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述样本进行成像包括使用排斥或消除离焦荧光的显微模式对所述样本进行成像。


8.一种用于使用荧光显微术对样本进行成像的系统，所述系统包括：
显微镜的检测物镜和根据所述检测物镜而安放的样本；
定位在所述样本周围的双凸抛物面镜包体，所述双凸抛物面镜包体包括彼此反平行定向的上抛物面镜和下抛物面镜，其中，在所述下抛物面镜中限定孔，半球形圆顶被安装在所述孔中，并且所述样本被所述半球形圆顶包围；以及
照明系统，被配置用于将激发光引导到所述样本上以在所述上抛物面镜的上顶点形成初级图像并且在所述下抛物面镜的下顶点处形成次级图像，以及通过所述检测物镜对所述样本进行成像。


9.根据权利要求8所述的系统，其中，所述半球形圆顶是光学透明的，并且以所述下抛物面镜的下顶点为中心。


10.根据权利要求9所述的系统，其中，所述半球形圆顶由玻璃形成并且具有均匀的厚度，其中，在所述半球形圆顶的顶部中限定圆...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·S·马多克斯，T·C·法德罗，
申请(专利权)人：查珀尔希尔北卡罗来纳大学，
类型：发明
国别省市：美国;US