AuNPs1-2 pH探针在男性不育症中的应用和产品制造技术

本发明专利技术公开了AuNPs1‑2 pH探针在男性不育症中的应用和产品，属于生物技术和临床医学检测技术领域。将AuNPs1‑2 pH探针应用制备检测男性不育症的产品中，其中，产品包括用于检测精子内pH值的试剂，利用AuNPs1‑2 pH探针监测男性精子内亚细胞局部pH变化及外界刺激下的pH变化，为临床原因不明不育症男性患者提供诊断参考及临床咨询，也将辅助寻找不育症男性患者的病因及发病机制。

【技术实现步骤摘要】
AuNPs1-2pH探针在男性不育症中的应用和产品
本专利技术涉及pH探针在男性不育症中的应用和产品，尤其涉及将AuNPs1-2pH探针应用于定性检测男性不育症及对应产品，属于生物技术和临床医学检测

技术介绍
多年来，对男性精液的常规分析，一直用于作为判断男性生育力的基本临床指标。而目前临床上对绝大部分的不育症男性患者的真正不育原因仍不清楚，尤其是临床上大约有三分之一不育症男性患者的常规精液分析结果均正常或者接近正常，临床上把这类患者归为“不明原因不育症”患者，因此，长期以来，临床对男性不育症的检测判断存在极大的困难。现有技术“CN200510078423.6一种用于男性不育症检测方法的检测试剂”中公开：制备五乙酰氧基葡萄糖苷，采用所得的五乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷，采用所得的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷；该检测试剂用于男性不育症，特别是生精障碍与输精障碍不育症鉴别的检测方法中，以适应仪器自动化分析。现有技术“CN201711284133.6EMC10蛋白作为生物标志物在诊断男性不育中的应用”中公开：提高EMC10蛋白活性和/或表达量的物质可以预防男性不育、治疗男性不育、促进精子和卵子受精、促进精子和去透明带的卵子受精、提高精子与胞膜融合的能力、治疗精子功能障碍、促进精子的成熟、促进精子在附睾中的成熟、提高精子的运动能力、提高精子获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化水平、促进精子的获能、提高精子的顶体反应能力、修复精子异常形态、恢复钠/钾APT酶的活性、维持精子内离子平衡、维持精子内Na+平衡、维持精子内HCO3平衡、维持精子内pH值平衡、提高男性生育能力。现有技术“CN201610147268.7一种精子质量评估的试剂盒及其使用方法”中公开：试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞裂解液、检测缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktail、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、荧光试剂、唾液酸酶标准原液和检测缓冲液2；检测缓冲液1为磷酸缓冲液或者BWW培养液；试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；试剂B液为：4％硫酸铜；检测缓冲液2为含0.05mmol/l乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。通过精子中唾液酸酶活性的检测，为临床原因不明的男性不育患者提供诊断依据及临床咨询。
技术实现思路
专利技术人在长期的研究中发现，不育症男性患者的精子内pH值较正常男性的精子内pH值小，且不育症男性患者的精子为酸性，再结合AuNPs1-2pH探针分子结构在不同pH环境下发生共轭体系的改变，从而产生不同强度、不同种类的荧光，即pH值越小，红色荧光强度越大；pH值越大，绿色荧光强度越大，其中，AuNPs1-2pH探针在pH4.5-8.0的范围内产生较明显的变色效果，而不育症男性患者的精子内pH值和正常男性精子内pH值均在该范围内，基于此，应用酸性环境中的AuNPs1-2pH探针分子中荧光共轭体系为红色荧光，并以正常男性精子内pH值为检测指标，可明显观察到不育症男性患者精子内pH值对应的红色荧光强度更显著。针对于现有技术的不足，以及临床实际需求，本专利技术提供AuNPs1-2pH探针在男性不育症中的应用和产品，其中，利用AuNPs1-2pH探针（纳米级pH探针）监测男性精子内亚细胞局部pH变化及外界刺激下的pH变化，为临床不明原因不育症男性患者提供诊断参考及临床咨询，也将辅助寻找不育症男性患者的病因及发病机制。为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：AuNPs1-2pH探针在男性不育症中的应用，包括所述AuNPs1-2pH探针在制备用于检测男性不育症的产品中的应用。其中，所述产品以正常男性精子内pH为检测指标，若精子样本基于AuNPs1-2pH探针检测的荧光异于正常男性精子基于AuNPs1-2pH探针检测的荧光，即精子样本的pH异于所述检测指标，则判断精子样本来自不育症男性患者；反之，则判断精子样本来于正常男性。进一步的，所述精子内pH包括正常情况下的精子内亚细胞局部的pH，或者，在外界刺激下精子内亚细胞局部的pH；其中，亚细胞包括溶酶体、线粒体等，外界刺激为孕酮刺激、NNC55-0396刺激等。进一步的，所述不育症男性患者包括弱精患者，其中，弱精患者的精子前向运动小于32。进一步的，所述不育症男性患者包括不明原因不育症男性患者。不明原因不育症男性患者是指精子各项检测指标均合格的不育症男性患者，其中，各项检测指标（精液理化特征）包括：禁欲天数2-7天，颜色灰白色，精液量≥1.5mL，pH≥7.2，粘度＜2cm，液化时间＜60min，凝聚结果阴性；精子浓度（SC）＞15*10^6/mL，前向运动（PR）＞32%，精子活动率（motility）＞40%，存活率（伊红-苯胺黑染色）＞58%，圆细胞浓度（roundcell）＜5*10^6/mL，白细胞浓度（WBC）＜1.0*10^6/mL；正常形态精子百分比（PNS）＞4%。AuNPs1-2pH探针在男性不育症中的产品，包括用于检测精子内pH值的试剂。进一步的，所述产品为试剂盒，试剂盒包括：多聚赖氨酸、AuNPs1-2pH探针和PBS缓冲液，PBS缓冲液pH为7。进一步的，所述PBS缓冲液包括浓度0.01mol/L的PO43-及质量分数为0.8%的NaCl。采用本技术方案，带来的有益技术效果为：1）本专利技术首次将AuNPs1-2pH探针技术应用在离体生殖细胞即精子内，并为临床不明原因不育症男性患者提供诊断参考及临床咨询，也将辅助寻找不育症男性患者的病因及发病机制；2）本专利技术可直观、形象、有效的观测正常男性精子内pH值及不育症男性患者精子内pH值的差异；3）在本专利技术中，AuNPs1-2pH探针在pH4.5-8.0的范围内产生较明显的变色效果，同时，相较于现有技术中常用的BCECF法测精子内pH值，本技术方案具有双显色、对精子样本的伤害小、显色灵敏度高及更易观察等特点。附图说明图1为AuNPs1-2pH探针在不同pH环境下发生共轭结构的改变从而产生不同颜色的荧光图；图2为正常男性精子于40X激光共聚焦显微镜下的效果图；图3为正常男性精子于100X激光共聚焦显微镜下的效果图；图4为正常男性精子与不育症男性患者精子分别于40X激光共聚焦显微镜下的效果图（Merge）；图5为正常男性精子与不育症男性患者精子分别于40X激光共聚焦显微镜下的效果图（Redchannel）；图6为正常男性精子与不育症男性患者精子内的pH差异统计图；图7为伊红染色法对比使用AuNPs1-2pH探针以及BCECF法测定精子内pH后，精子活力结果图（其中，箭头指向为死亡精子）；图8为伊红染色法对比使用AuNPs1-2pH探针以及BCECF法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.AuNPs1-2 pH探针在男性不育症中的应用，其特征在于，包括所述AuNPs1-2 pH探针在制备用于检测男性不育症的产品中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.AuNPs1-2pH探针在男性不育症中的应用，其特征在于，包括所述AuNPs1-2pH探针在制备用于检测男性不育症的产品中的应用。


2.根据权利要求1所述的AuNPs1-2pH探针在男性不育症中的应用，其特征在于，所述产品以正常男性精子内pH为检测指标，若精子样本基于AuNPs1-2pH探针检测的荧光异于正常男性精子基于AuNPs1-2pH探针检测的荧光，即精子样本的pH异于所述检测指标，则判断精子样本来自不育症男性患者；反之，则判断精子样本来于正常男性。


3.根据权利要求2所述的AuNPs1-2pH探针在男性不育症中的应用，其特征在于，所述精子内pH包括正常情况下的精子内亚细胞局部的pH，或者，在外界刺激下精子内亚细胞局部的pH。


4.根据权利要求1-3中任意一项所述的AuNPs1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴思娴，栗晓亮，于抗抗，许文明，余孝其，李坤，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：四川;51