超灵敏数字层析快速检测分析物的系统及方法技术方案

本发明专利技术提供一种超灵敏数字层析快速检测系统及方法，检测系统主要包括：层析反应系统、光学成像系统和图像处理系统。其中层析反应系统为侧向或纵向层析反应系统，层析反应系统的反应膜上的检测区域固定捕获生物配体，通过生物配体特异性捕获富集的待测分析物，示踪纳米颗粒标记的检测生物配体特异性识别检测区域富集的待测分析物；其中光学成像系统能分辨反应膜上特异性结合的单个示踪纳米颗粒；其中图像处理系统包括检测区域识别模块和特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块，统计检测区域特异性结合的示踪纳米颗粒数量与待测分析物的浓度成比例关系。本发明专利技术的检测系统和方法可以显著提高荧光或者胶体金层析分析方法的检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
超灵敏数字层析快速检测分析物的系统及方法
本专利技术涉及一种生物检测系统，尤其涉及一种超灵敏快速检测分析物的系统，具体涉及到一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统。此外，本专利技术还涉及超灵敏数字层析快速检测分析物的方法。背景超灵敏检测分析的方法在临床疾病检测、食品安全、微生物检验检疫、兽医等领域都具有广阔的应用前景。数字检测分析技术是指通过对特异性反应进行绝对计数，从而提高检测分析的灵敏度。目前，常见的数字分析技术包括数字PCR、数字ELISA等，其基本原理是将一个样本分成几千到几万份，分配到不同反应单元的待测目标分子，在每个反应单元中进行反应，反应结束后计数发生阳性反应的微分单元数量，实现对目标分析物的超灵敏检测。例如美国Quanterix公司推出的数字ELISA技术，与传统的免疫检测的主要区别在于能够在飞升大小的微孔内捕获单分子，允许单个磁珠的信号的数字化读取，该技术的检测灵敏度比传统的ELISA方法提高1000倍。此外，通过对发生特异性结合反应的单纳米颗粒计数，也可以实现对目标分析物的超微量检测，例如NongjianTao等报道（ACSSens.2020,5,4,1126–1131），在玻璃载玻片表面固定抗体，与金纳米颗粒修饰的标记抗体结合，采用暗场显微镜观察单个金纳米颗粒，对特异性结合的金纳米颗粒计数，可实现对肌钙蛋白的超灵敏检测。但上述检测方法步骤繁琐、耗时长、检测系统难于标准化，不适于开发现场、快速检测试剂盒。中国专利技术专利申请CN201811282815.8公开了一种基于数字免疫分析技术的低丰度蛋白质绝对定量方法，该方法将捕获磁珠、目标抗原和检测颗粒进行免疫反应后，将免疫复合物重点检测颗粒洗脱，用微流控颗粒计数芯片分析检测颗粒数量。但上述数字免疫分析方法也存在检测步骤复杂，试剂难于标准化的问题。中国专利技术专利申请CN202010449078.7公开了一种多光谱调制的便携式免疫层析试纸条定量检测装置，该专利技术中光学检测模块将调制过的光入射到待检测的试纸条上，在45度接收角将C线和T线反射光或者荧光引导至多光谱检测模块，由于上述检测方法采集检测颗粒的宏观整体信号，对超微量，尤其单个检测颗粒的信号无法检测识别，因而限制了该分析方法的检测灵敏度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，克服了现有数字检测方法步骤繁琐、耗时长、检测系统难于标准化的缺陷，简化了检测步骤，缩短了检测时间，检测系统易于标准化，实现对目标分析物的超灵敏、现场快速检测，提高现有层析检测技术的分析灵敏度。为此，本专利技术还提供一种超灵敏数字层析快速检测分析物的方法。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，包括：层析反应系统，光学成像系统和图像处理系统；所述的层析反应系统为侧向或纵向层析反应系统，其中侧向层析反应系统包括样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；纵向层析反应系统包括反应膜、吸水纸和组装卡壳；所述层析反应系统的反应膜上的检测区域固定捕获生物配体，通过生物配体特异性捕获富集的待测分析物，示踪纳米颗粒标记的检测生物配体特异性识别检测区域富集的待测分析物；所述光学成像系统为荧光显微放大或者暗场显微放大光学系统，能分辨所述层析反应系统的反应膜上特异性结合的单个示踪纳米颗粒；所述图像处理系统包括检测区域识别模块和特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块，统计检测区域特异性结合的示踪纳米颗粒数量与待测分析物的浓度成比例关系。作为本专利技术优选的技术方案，所述层析反应系统为侧向或者纵向层析反应系统，层析反应时间小于20分钟。作为本专利技术优选的技术方案，所述层析反应系统的检测区域，除了固定特异性捕获生物配体外，还固定了检测区域标示性微粒。所述检测区域标示性微粒，可以为荧光波长区别于示踪颗粒的荧光纳米颗粒，或者是在显微成像系统下可分辨的各种形状微粒。优选地，所述示踪纳米颗粒的粒径为10-500nm，粒径分布均一，示踪纳米颗粒是荧光纳米颗粒或者等离子体纳米颗粒，荧光纳米颗粒为时间分辨荧光、有机荧光染料、荧光量子点、聚集诱导荧光中的一种或者几种组合，等离子体纳米颗粒为金、铂、银、钯纳米颗粒中的一种或者几种组合。优选地，所述生物配体为抗原、抗体、核酸适配体、链霉亲和素、生物素中的一种或几种组合。优选地，所述光学成像系统的放大倍数为100-1000倍，能分辨单个示踪纳米颗粒。优选地，所述检测区域识别模块能识别光学成像系统采集到的反应膜上的图像，通过检测区域标示性微粒识别反应膜上的检测区域。优选地，所述特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块能统计检测区域中特异性结合的示踪纳米颗粒的数目。此外，本专利技术还提供一种采用上述系统的超灵敏数字层析快速检测分析物的方法，包括如下步骤：步骤1，一定体积的样本滴加到层析反应系统上，层析反应后，在光学成像系统上获取层析反应系统的反应膜上检测区域的显微图像，通过图像处理系统对检测区的示踪纳米颗粒进行计数；步骤2，通过校准品浓度与示踪纳米颗粒数量间的拟合关系曲线，计算得到样本中待测分析物的浓度。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术通过显微信号放大和单纳米颗粒计数相结合的方式，可显著提高免疫层析检测方法的检测分析灵敏度，在试剂的检测区域除了固定捕获配体外，还固定标识性纳米微粒对检测区域进行标记，便于显微定位检测区域，并降低反应膜与标记颗粒间非特异性结合的信号干扰，通过显微光学信号放大，实现对检测区域特异性结合的示踪颗粒的单颗粒计数，建立检测区域中特异性示踪颗粒数量与待测标志物浓度的关系曲线，与传统的肉眼判读或者基于宏观信号收集的免疫层析分析仪相比较，该检测系统和方法可以明显提高荧光或者胶体金免疫层析分析方法的检测灵敏度，且克服了现有数字检测方法步骤繁琐、耗时长、检测系统难于标准化的缺陷，简化了检测步骤，缩短了检测时间，检测系统易于标准化，且具有层析试纸的快速、便捷、低成本、易于工业化生产等优点。附图说明下面结合附图对本专利技术做进一步的描述。图1为本专利技术的超灵敏数字层析快速检测系统的组成结构示意图。图2为本专利技术实施例一中标准荧光膜条在荧光成像仪和荧光显微镜的检测结果比较示意图，是不同浓度的标准荧光条带的荧光成像仪照片和低浓度标准荧光条带的荧光显微照片的比较。图2中，标准荧光膜条1-8的划膜荧光颗粒浓度依次为：1.2，4.8，19.2，76.8，307.2，1228，4915，19661（百个每厘米）。图3为本专利技术实施例一中标准荧光膜条的显微颗粒计数与荧光免疫分析仪对标准荧光膜条的检测结果比较示意图。图4为本专利技术实施例二中侧向层析反应系统的结构示意图。图4中，9-样品垫，10-结合垫，11-反应膜，12-检测区，13-质控区，14-吸水垫，15-PVC不干胶背板。图5为本专利技术实施例二中量子点荧光侧向免疫层析检测HIVp24不同检测浓度，检测区的荧光显微照片。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，包括：层析反应系统，光学成像系统和图像处理系统；/n所述的层析反应系统为侧向或纵向层析反应系统，其中侧向层析反应系统包括样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；纵向层析反应系统包括反应膜、吸水纸和组装卡壳；所述层析反应系统的反应膜上的检测区域固定捕获生物配体，通过生物配体特异性捕获富集待测分析物，示踪纳米颗粒标记的检测生物配体特异性识别检测区域富集的待测分析物；/n所述光学成像系统为荧光显微放大或者暗场显微放大光学系统，能分辨所述层析反应系统的反应膜上特异性结合的单个示踪纳米颗粒；/n所述图像处理系统包括检测区域识别模块和特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块，统计检测区域特异性结合的示踪纳米颗粒数量与待测分析物的浓度成比例关系。/n

【技术特征摘要】
1.一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，包括：层析反应系统，光学成像系统和图像处理系统；
所述的层析反应系统为侧向或纵向层析反应系统，其中侧向层析反应系统包括样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫；纵向层析反应系统包括反应膜、吸水纸和组装卡壳；所述层析反应系统的反应膜上的检测区域固定捕获生物配体，通过生物配体特异性捕获富集待测分析物，示踪纳米颗粒标记的检测生物配体特异性识别检测区域富集的待测分析物；
所述光学成像系统为荧光显微放大或者暗场显微放大光学系统，能分辨所述层析反应系统的反应膜上特异性结合的单个示踪纳米颗粒；
所述图像处理系统包括检测区域识别模块和特异性结合示踪纳米颗粒的计数模块，统计检测区域特异性结合的示踪纳米颗粒数量与待测分析物的浓度成比例关系。


2.根据权利要求1所述的一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，所述层析反应系统为侧向或者纵向层析反应系统，层析反应时间小于20分钟。


3.根据权利要求1所述的一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，所述层析反应系统的检测区域，除了固定了特异性捕获生物配体外，还固定了检测区域标示性微粒。


4.根据权利要求3所述的一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，所述检测区域标示性微粒，为荧光发射波长区别于示踪颗粒的荧光纳米颗粒，或者是在显微成像系统下可分辨的各种形状微粒。


5.根据权利要求1所述的一种超灵敏数字层析快速检测分析物的系统，其特征在于，所述示踪纳米颗粒的粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏飞，陈中建，谭飞，严万年，范凌志，
申请(专利权)人：上海市皮肤病医院，
类型：发明
国别省市：上海;31