检测或确定丙型肝炎病毒核心蛋白的方法及其中应用的用于检测或确定的试剂技术

本发明专利技术提供了一种检测样品中ＨＣＶ核心抗原的免疫测定，包括使碱性磷酸酶标记的抗－ＨＣＶ核心蛋白抗体和样品中的ＨＣＶ核心抗原在含有高浓度盐的水溶液中进行抗原－抗体反应，形成抗原－抗体复合物，然后测定形成的抗原－抗体复合物的碱性磷酸酶活性。还提供了一种检测ＨＣＶ核心抗原的试剂，其包括碱性磷酸酶标记的抗－ＨＣＶ核心蛋白抗体，浓度为０．５Ｍ至饱和的盐，以及测定碱性磷酸酶活性的试剂。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测或确定丙型肝炎病毒(HCV)的方法以及检测或确定HCV的试剂。用于检测感染的病因性病毒的方法是抗体试验、抗原试验和遗传试验。免疫测定是抗体试验和抗原试验的基本方法，广泛应用于病毒感染的诊断，输血用血液之病毒筛选试验，监测病毒感染的治疗等。遗传试验可以利用基因扩增法进行，例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)、具有改进的标记效能的分支DNA(bDNA)方法等，这些方法能够进行高灵敏度地测定。遗传试验不仅用于确定诊断，而且用于检测水平在上述抗体试验和抗原试验检测水平限之下的病毒，以及评价药物治疗中的病毒消除。近来，期望将基因扩增法应用于输血用血液的筛选试验，以检测抗体试验或抗原试验不能检测到的早期病毒感染。然而，遗传试验还存在多种问题；例如，程序复杂，需要特殊装置，需要技术人员，花费高昂，缺乏足够的重现性和测量精确性，不适合处理大量样品，由于样品中的抑制因素易于显示假阴性结果，与样品中的蛋白质相比核酸自身不稳定，而且基因的扩增效能不一致。据报道，如果来源于病毒的核酸是RNA，则核酸仍然不太稳定，得出根据试验方法和试验样品的保存条件而变化很大的结果。抗病毒抗体的试验，即检测体内免疫机制产生的抗病毒抗体，是观察病毒感染效果的方法。针对抗原的抗体的产生在不同个体中各不相同；即，存在表现高抗体效价的个体和根本不能产生抗体的个体。而且，难以预测患者的实际状况和患者体内的病毒量，因为抗体量不一定对应于病毒量。还存在不能做出准确判断的问题，因为病毒感染的早期不产生抗体，这就不可能检测早期感染，还观察到抗体的非特异性反应。抗原试验是检测来源于病毒的抗原的方法，商业提供了多种用于来源于病毒的抗原的测定系统。对于抗原试验，主要应用利用识别病毒来源抗原的抗体的免疫测定，但与基因扩增法相比它的灵敏度不够好。于是，还存在小量病毒不能被准确检测到的问题。而且，病毒和抗病毒抗体在体内共同存在，这些共存的抗体和免疫测定中应用的抗体竞争性地与抗原反应，有时这使得难于高灵敏度地测定抗原。已经研究出一些检测HBV和其它肝炎病毒、HIV等的抗原测定系统，但它们比DNA扩增法例如PCR灵敏度低，不足以用作诊断或治疗的标志。近来，研究出一种用于HCV核心蛋白质(HCV的内部抗原)的测定系统(日本公开而未审的专利申请，公开号29427/96)。与测定基因的方法相比，该方法简便，能够稳定测定，该方法中应用的试剂盒用于HCV的确诊和HCV治疗效能的预测和判断。然而，与PCR法相比，该方法灵敏度不够好，因此单独该HCV核心蛋白测定法不足以用作诊断或治疗的标志。实际上，该方法的检测限为8pg/ml(PCR滴度为104-5病毒粒/ml)，它高于PCR法的局限10倍以上。因此，在判断治疗效果时，HCV核心蛋白含量为8pg/ml或更低的样品被判断为阴性，这意味着该方法不能检测小量病毒。通常知道抗原-抗体反应中应用高浓度的盐会抑制反应，并使抗原从抗原-抗体反应产物中解离出来。例如，超灵敏酶免疫测定的第9章中有下列描述“因为蛋白质与固相的非特异性吸附依条件而改变，因此期望通过调整条件减少血清的相互作用，从而降低非特异性吸附的程度。在胰岛素夹心免疫测定中，通过降低与抗-胰岛素IgG-固定化聚苯乙烯小珠一同培养的血清浓度和减少培养时间而降低了血清干扰(表Ⅸ-14)(Ruan等，1986)。还可以通过增加无机盐的浓度降低蛋白质与固相非特异性吸附的程度，而降低血清干扰(表Ⅸ-15，图Ⅸ-18-Ⅸ-21)(Hashida，等1983)。有效浓度根据无机盐的种类而改变；然而，如果浓度太高，免疫反应自身被抑制。例如，对于氯化钠，最高浓度可以是0.3-0.4mol/l。”本专利技术的目的在于提供一种检测或确定HCV抗原的方法，它能够简便和高灵敏度地检测或确定HCV抗原，适用于需处理大量样品的血液交易和健康检查中筛选，本专利技术的目的还在于提供所述方法中应用的检测或确定HCV抗原的试剂。本专利技术人出乎意料地发现，与应用其它物质而不是碱性磷酸酶标记抗HCV核心蛋白抗体的情况不同，使碱性磷酸酶标记的抗HCV核心蛋白抗体和HCV核心蛋白在含有高浓度盐的水溶液中进行抗原-抗体反应，能够高灵敏度地检测HCV核心抗原，而不抑制免疫反应。本专利技术基于这些发现完成。本专利技术涉及下列(1)-(29)方面(1)检测或确定样品中HCV核心抗原的免疫测定，包括使碱性磷酸酶标记的抗-HCV核心蛋白抗体和样品中的HCV核心抗原在含有高浓度盐的水溶液中进行抗原-抗体反应，形成抗原-抗体复合物，然后测定形成的抗原-抗体复合物的碱性磷酸酶活性。(2)按照(1)的免疫测定，其中盐是卤化碱金属盐。(3)按照(1)的免疫测定，其中盐是氯化钠。(4)按照(1)-(3)之一的免疫测定，其中盐浓度为0.5M至饱和。(5)按照(1)-(4)之一的免疫测定，其中抗-HCV核心蛋白的抗体是识别HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列中至少5个连续氨基酸残基序列的抗体。(6)按照(1)-(4)之一的免疫测定，其中抗-HCV核心蛋白抗体选自KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。(7)按照(1)-(6)之一的免疫测定，其中样品在进行抗原-抗体反应之前，用促溶物质和/或碱性试剂处理。(8)按照(7)的免疫测定，其中促溶物质是胍盐。(9)按照(7)或(8)的免疫测定，其中碱性试剂是氢氧化碱金属。(10)按照(7)-(9)之一的免疫测定，其中促溶物质的浓度为1M至饱和。(11)按照(7)-(10)之一的免疫测定，其中碱性物质的处理在45-55℃下进行。(12)检测或确定HCV核心抗原的试剂，包括一种碱性磷酸酶标记的抗-HCV核心蛋白抗体，一种浓度为0.5M至饱和的盐，和一种测定碱性磷酸酶活性的试剂。(13)按照(12)的试剂，其中盐是卤化碱金属盐。(14)按照(12)或(13)的试剂，其中盐是氯化钠。(15)按照(12)-(14)之一的试剂，其中抗-HCV核心蛋白抗体是识别HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列中至少5个连续氨基酸残基序列的抗体。(16)按照(12)-(14)之一的试剂，其中抗-HCV核心蛋白抗体选自KTM-145、KTM-153、KTM-157、KTM-163和KTM-167。(17)检测或确定HCV核心抗原的试剂盒，包括(12)-(16)之一的试剂和包含促溶物质和/或碱性试剂的样品处理试剂。(18)按照(17)的试剂盒，其中促溶物质是胍盐。(19)按照(17)或(18)的试剂盒，其中碱性试剂是氢氧化碱金属盐。(20)按照(17)-(19)之一的试剂盒，其中促溶物质的浓度为1M至饱和。(21)识别HCV核心蛋白N-末端11-50位氨基酸序列中至少5个连续氨基酸残基序列的单克隆抗体。(22)识别HCV核心蛋白N-末端41-50位氨基酸序列的单克隆抗体。(23)按照(22)的单克隆抗体，其由杂交瘤KTM-145(FERMBP-6838)制备。(24)识别HCV核心蛋白N-末端11-30位氨基酸序列的单克隆抗体。(25)按照(24)的单克隆抗体，其由杂交瘤KTM-153(FERMBP-6839)制备。(26)识别本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测或确定样品中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心抗原的免疫测定，包括使碱性磷酸酶标记的抗－ＨＣＶ核心蛋白抗体和样品中的ＨＣＶ核心抗原在含有高浓度盐的水溶液中进行抗原－抗体反应，形成抗原－抗体复合物，然后测定形成的抗原－抗体复合物的碱性磷酸酶活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：守田和树，西田绫子，福井正宪，近藤大，小原道法，
申请(专利权)人：协和梅迪克斯株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]