高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法技术

本发明专利技术涉及高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法。本发明专利技术提供能够简便且准确地进行测定的高密度脂蛋白(HDL)中的胆固醇的测定方法。一种样本中的高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样本与i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶在含有选自由特定结构的吡啶

Determination of cholesterol in high density lipoprotein

The present invention relates to a method for the determination of cholesterol in high-density lipoprotein. The present invention provides a simple and accurate method for the determination of cholesterol in high-density lipoprotein (HDL). A method for determination of high density lipoprotein cholesterol in the sample, which is characterized in that the sample with I) cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase or cholesterol ester hydrolase, II), oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase in selected specific structure containing pyridine

【技术实现步骤摘要】
高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法本申请是申请日为2013年8月30日、国际申请号为PCT/JP2013/073250、中国申请号为201380043988.3的专利申请的分案申请。
本专利技术涉及样本中的高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法、测定试剂及测定用试剂盒。
技术介绍
生物体中的脂蛋白根据其比重被分类为高密度脂蛋白(以下简记为HDL)、低密度脂蛋白(以下简记为LDL)、超低密度脂蛋白(以下简记为VLDL)、乳糜微粒(以下简记为CM)，各脂蛋白主要由于载脂蛋白的种类的不同而使其在生物体中的作用大不相同，脂质组成也各种各样。其中，已知HDL从包括动脉壁在内的各组织中接收胆固醇，因此与蓄积在细胞内的胆固醇的除去作用相关，是以冠状动脉硬化为代表的各种动脉硬化的危险预防因子，其血中水平成为用于预知动脉硬化疾病的发病的有用指针。以往的HDL中的胆固醇(以下简记为HDL胆固醇)的测定由利用超速离心法、免疫化学方法、电泳法、沉淀法的分级操作和胆固醇定量这两个阶段构成。但是，分级操作的操作繁杂，需要长时间，并且在安全性方面也存在问题。因此，伴有这些分离操作的测定方法效率极低，是不适合实用的方法。近年来，为了解决上述问题，报道了各种测定方法。已知例如：使血清或血浆在含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶以及胆汁酸盐或胆汁酸衍生物或磺基琥珀酸二辛酯的缓冲液中与该酶反应来特异性地对HDL胆固醇进行分别定量的方法(参考专利文献1)；通过使血清在特定的pH和特定的温度下在含有胰腺来源的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆汁酸族的表面活性剂和非离子型表面活性剂的缓冲液中与该酶反应来测定HDL胆固醇的方法(参考专利文献2)。专利文献2记载的测定方法中，首先进行LDL胆固醇与该酶的反应，接着能够进行HDL胆固醇的测定。但是，这些测定中，需要长时间进行测定，另外，不一定是对HDL胆固醇具有特异性的测定方法。作为使HDL以外的脂蛋白凝集来测定HDL胆固醇的方法，已知例如：使用硫酸葡聚糖等使HDL以外的脂蛋白凝集的试剂、二价的金属盐和经过化学修饰的酶的方法(参考专利文献3)；使用聚阴离子等与HDL以外的脂蛋白形成复合物的试剂和聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物等不溶解脂蛋白的表面活性剂的测定方法(参考专利文献4)；使用硫酸葡聚糖等聚阴离子、二价的金属盐、特定的非离子型表面活性剂和与来自试样的白蛋白不同的白蛋白的测定方法(参考专利文献5)；一种测定血清或血浆中的HDL胆固醇的方法，其特征在于，将血清或血浆用含有脂蛋白分级剂(硫酸葡聚糖等聚阴离子与镁离子等二价阳离子的组合)的溶液进行处理，使所得到的混合液在不进行固体和液体的分离处理的情况下在阴离子型表面活性剂(烷基磺酸或胆汁酸或其衍生物)的存在下与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应，测定生成的过氧化氢(参考专利文献6)；等。作为不使HDL以外的脂蛋白凝集而测定HDL胆固醇的方法，已知例如：使生物试样与胰腺来源的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶在胆汁酸或其盐和白蛋白的存在下反应，测定由该酶反应消耗或生成的化合物，由此测定生物试样中的HDL胆固醇的方法(参考专利文献7)；在对HDL级分具有反应选择性的HLB值为16以上的非离子型表面活性剂的存在下，使样本与优先作用于HDL级分的脂蛋白脂肪酶和/或胆固醇酯酶以及胆固醇氧化酶反应，测定样本中的HDL胆固醇的方法(参考专利文献8)；等。另外，还已知如下方法：利用酰基聚氧乙烯失水山梨醇酯将HDL以外的脂蛋白中的胆固醇优先转化为过氧化氢，将生成的过氧化氢除去后，添加聚氧乙烯烷基酯，由此利用酶法测定HDL胆固醇(参考专利文献9)。另外，还已知：一种样本中的HDL胆固醇的测定方法，其特征在于，使样本与i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶在含有非离子型表面活性剂、聚阴离子和白蛋白的水性介质中反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶(参考专利文献10)；一种HDL胆固醇的测定方法，其特征在于，使样本与i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶在含有特定结构的季铵盐或胺类和聚阴离子的水性介质中反应，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶(参考专利文献11)。在通过光学方法进行样本中的特定物质的测定的情况下，在来自于肝病、胆管疾病的患者的样本中，出现磷脂和游离型胆固醇增加的异常脂蛋白(LpX)，LpX对测定体系产生光学影响，无法得到正常的测定值，从而成为问题。为了避免该光学影响，通常已知使反应液中的盐类为高浓度来消除由不溶于水的蛋白引起的浑浊的方法。但是，对于HDL胆固醇的测定而言，可能会由于存在高浓度的盐类而导致对HDL胆固醇的特异性降低，进而导致所含有的酶失活。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开昭62-69999号公报专利文献2：日本特开昭63-126498号公报专利文献3：日本特开平8-131197号公报专利文献4：日本特开平8-201393号公报专利文献5：日本特开平9-285298号公报专利文献6：日本特开平8-116996号公报专利文献7：国际公开第97/40376号小册子专利文献8：国际公开第00/52480号小册子专利文献9：日本特开平9-299号公报专利文献10：国际公开第2004/035816号小册子专利文献11：国际公开第2006/118199号小册子
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的目的在于提供能够简便且准确地进行测定的HDL胆固醇的测定方法、测定用试剂及测定用试剂盒。用于解决问题的手段本专利技术的专利技术人为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现了如下见解：在具有吡啶盐或季铵盐的结构的特定的含氮物质和聚阴离子的共存下，胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶特异性地作用于HDL胆固醇，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及下述[1]～[13]。[1]一种样本中的高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样本与i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶在含有选自由通式(I)表示的物质和通式(II)表示的物质组成的组中的至少一种物质以及聚阴离子的水性介质中反应而生成过氧化氢或还原性辅酶，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶，式(I)中，R1表示取代或未取代的碳原子数8～14的烷基或烯基，Ra表示氢原子、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，n表示1～5的整数，X-表示一价的阴离子，式(II)中，R2表示取代或未取代的碳原子数6～30的烷基或烯基，R3表示取代或未取代的碳原子数1～6的烷基或碳原子数2～6的烯基，R4表示氢原子、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子。[2]如[1]所述的方法，其中，水性介质还含有白蛋白。[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，聚阴离子为硫酸葡聚糖或其盐。[4]一种高密度脂蛋白中的胆固醇的测定用试剂，其特征在于，含有选自由通式(I)表示的物质和通式(II)表示的物质组成的组中的至少一种物质、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂，式(I)中，R1表示取代或未取代的碳原子数8～14的烷基或烯基，Ra表示氢原子、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，n表示1～5的整数，X-表示一价的阴离子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种样本中的高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样本与i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶在含有通式(II)表示的物质和聚阴离子的水性介质中反应而生成过氧化氢或还原型辅酶，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶，

【技术特征摘要】
2012.08.31 JP 2012-1911441.一种样本中的高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样本与i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶在含有通式(II)表示的物质和聚阴离子的水性介质中反应而生成过氧化氢或还原型辅酶，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶，式(II)中，R2表示取代或未取代的碳原子数6～30的烷基或烯基，R3表示取代或未取代的碳原子数1～6的烷基或碳原子数2～6的烯基，R4表示氢原子、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子。2.如权利要求1所述的方法，其中，水性介质还含有白蛋白。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，聚阴离子为硫酸葡聚糖或其盐。4.一种高密度脂蛋白中的胆固醇的测定用试剂，其特征在于，含有通式(II)表示的物质、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂，式(II)中，R2表示取代或未取代的碳原子数6～30的烷基或烯基，R3表示取代或未取代的碳原子数1～6的烷基或碳原子数2～6的烯基，R4表示氢原子、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子。5.一种高密度脂蛋白中的胆固醇的测定用试剂，其特征在于，含有通式(II)表示的物质、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶，式(II)中，R2表示取代或未取代的碳原子数6～30的烷基或烯基，R3表示取代或未取代的碳原子数1～6的烷基或碳原子数2～6的烯基，R4表示氢原子、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子。6.如权利要求5所述的试剂，其中，还含有还原型辅酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐佐木理惠，片山有基，
申请(专利权)人：协和梅迪克斯株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP