IDO2活性的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种快速、可靠的检测吲哚胺2,3-双加氧酶2活性的方法。具体地，提供了一种非诊断性地IDO2活性测定方法，在pH7.2-7.8的缓冲体系中，将待测样品与浓度为5-500mmol/L的L-色氨酸进行反应，终止反应后8000-20000g离心，显色并通过反应体系的吸光度计算IDO2活性。本发明专利技术的方法便捷、高效，结果可靠，可以用于IDO2抑制剂的筛选。

Detection method of IDO2 activity

The present invention provides a fast and reliable method for detecting indole amine 2,3- double oxygenase 2 activity. Specifically, provides a method for the determination of non diagnostic IDO2 activity in the buffer of pH7.2-7.8, the sample with concentration of L- tryptophan 5-500mmol/L reaction, after the reaction was terminated 8000-20000g centrifugation, color and IDO2 was calculated through the absorbance of the reaction system activity. The method of the invention is convenient, efficient and reliable, and can be used for the screening of IDO2 inhibitors.

【技术实现步骤摘要】
IDO2活性的检测方法
本专利技术涉及生物检测领域，更具体地涉及一种检测IDO2活性的方法。
技术介绍
吲哚胺2，3-双加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1,IDO1)是哺乳动物中催化色氨酸沿着犬尿氨酸途径(kynureninepathway)代谢的第一个限速酶。研究表明IDO1在多种肿瘤组织中有高表达，可以通过降低肿瘤微环境中色氨酸浓度来抑制淋巴细胞的增殖，在肿瘤免疫逃逸中起到重要作用，因此,目前认为IDO1的高表达是导致机体对肿瘤产生免疫耐受的重要因素之一。Ball等在2007年发现了一种在编码基因序列、分子结构及生物活性上与IDO1都十分相似的酶，并命名为INDOL1(indoleamine2,3-dioxygenase-likeprotein)，即现在的吲哚胺2，3-双加氧酶2(indoleamine2,3-dioxygenase2,IDO2)。IDO2位于IDO1基因的下游，在结构上IDO2的序列和IDO1的序列高度相似，位于人和小鼠的第八号染色体上，在小鼠的肾脏，生殖系统，肝脏中高表达。有研究发现在胃癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌的癌组织中也有IDO2的表达。多项研究表明尽管活性比IDO1低，且不起主导作用，但IDO2也能催化色氨酸的降解。研究表明，IDO2与IDO1关系密切，两者可能共同作用参与肿瘤发生、肿瘤免疫耐受、炎症反应等重大疾病或生理活动，因此IDO2有望成为继IDO1之后治疗人类重大疾病的有效药物靶标。IDO1在肿瘤的免疫耐受中的重要作用已被人们所承认，并且在基因表达、信号转导、用于具有IDO1介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病(包括癌症、艾滋病、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等重大疾病)的治疗等方面成为研究热点。IDO2与IDO1的结构相似，编码基因位置相邻，并且有研究表明，特异性抑制IDO2后可表现出更强的抗肿瘤效果。然而，目前本领域关于IDO2的生物学特征、功能与免疫耐受的研究还相对较少，也没有成熟的IDO2检测方法，阻碍了IDO2的进一步研究以及IDO2抑制剂的研究。因此，本领域迫切需要开发完善可靠IDO2检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种完善可靠的检测IDO2活性的方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种非诊断性地检测吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO2)活性的方法，包括步骤：(i)提供一待测IDO2样品，和pH7.2-7.8的缓冲体系，所述缓冲体系中包含浓度为5-500mmol/L的L-色氨酸；(ii)将所述的待测IDO2样品和缓冲体系混合并反应，获得含N-甲酰犬尿氨酸的反应混合物；(iii)对反应混合物进行终止反应；(iv)对反应混合物进行转化，从而将N-甲酰犬尿氨酸转化为犬尿氨酸；(v)对反应混合物进行离心，获得上清液；(vi)对上清液进行显色反应，并测定上清液的吸光度；(vii)基于测得的吸光度，判断IDO2的酶活性。在另一优选例中，在步骤(v)中，所述离心的离心力为8000-20000g，较佳地为10000-15000g，更佳地为12000-14000g。在另一优选例中，在步骤(v)中，所述离心的时间为5-20min，较佳地为8-10min。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述IDO2样品包含重组IDO2。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述IDO2样品中重组IDO2的含量为80-100％，较佳地为90-100％，按样品的总重量计。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述重组IDO2的编码基因序列如SEQIDNO.:5、或SEQIDNO.:6所示。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述的重组IDO2为人的IDO2。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述缓冲体系的pH为7.3-7.7，较佳地为7.4-7.6，更佳地为7.5。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述L-色氨酸的浓度为10-100mmol/L，较佳地为10-50mmol/L。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述的缓冲体系还包含浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液、浓度为200μg/mL的过氧化氢酶、浓度为40mmol/L的抗坏血酸、和浓度为20μmol/L的亚甲基蓝。在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述反应的温度为30-42℃，较佳地为35-40℃，更佳地为36-37℃。在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述反应的时间为10-60min，较佳地为20-40min，更佳地为25-30min。在另一优选例中，所述方法还包括，位于步骤(ii)之前的步骤：(ii0)将所述缓冲体系保温一段时间。在另一优选例中，在步骤(ii0)中，所述保温的温度为30-42℃，较佳地为35-40℃，更佳地为36-37℃。在另一优选例中，在步骤(ii0)中，所述保温的时间为2-10min，较佳地为3-5min。在另一优选例中，在步骤(iii)中，加入三氯乙酸从而终止反应。在另一优选例中，在步骤(iv)中，所述转化的温度为60-70℃，较佳地为62-68℃，更佳地为64-65℃。在另一优选例中，在步骤(iv)中，所述转化的时间为10-20min，较佳地为13-15min。在另一优选例中，在步骤(vi)中，加入对二甲氨基苯甲醛从而使上清液显色。在另一优选例中，在步骤(vi)中，所述对二甲氨基苯甲醛的浓度为2‰-3‰(w/v)。在另一优选例中，在步骤(vi)中，在波长为488-495nm，较佳地为490-492nm的条件下进行检测，从而测得上清液吸光度。在本专利技术的第二方面，提供了一种筛选抑制IDO2活性的候选化合物的方法，包括步骤：(a)提供一待测化合物，用本专利技术第一方面所述的方法检测IDO2的活性，并判断待测化合物对IDO2的抑制情况，从而选出对IDO2有抑制作用的待测化合物，作为经初筛的候选化合物。在另一优选例中，在步骤(a)中，在实验组中，在加入所述的待测化合物并在IDO2存在的条件下，测定IDO2的酶活，记为Mt；并且在不存在所述待测化合物且其他条件相同的对照组中，测定IDO2的酶活，记为Mc；并对Mt和Mc进行比较；其中，如果Mt显著低于Mc，则表明所述的待测化合物为抑制IDO2的待测化合物，即作为经初筛的候选化合物；如果Mt显著高于Mc，则表明所述的待测化合物为促进IDO2的待测化合物。在另一优选例中，所述的“显著低于”指Mt/Mc≤1/1.5，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3。在另一优选例中，所述的“显著高于”指Mt/Mc≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。在另一优选例中，所述方法还包括，位于步骤(a)之后的步骤：(b)测试经初筛的候选化合物在细胞水平抑制IDO2活性的情况，从而选出在细胞水平也能抑制IDO2活性的化合物，作为候选化合物。在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括设置阳性对照组、和/或阴性对照组。在另一优选例中，在所述方法中还包括：基于待测化合物对IDO2的抑制情况，判断所述待测化合物对IDO2的抑制类型。在另一优选例中，所述“判断所述待测化合物对IDO2的抑制类型”包括步骤：(i)分别在不同色氨酸浓度的缓冲体系中，用本专利技术第一方面所述的方法检测IDO2的活性，测定所述待测化合物在n个不同浓度下对IDO2的抑制情况，其中，n为≥3的正整数(较佳地5≤n≤20，更佳地6≤n≤1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非诊断性地检测吲哚胺2,3‑双加氧酶2(IDO2)活性的方法，其特征在于，包括步骤：(i)提供一待测IDO2样品，和pH7.2‑7.8的缓冲体系，所述缓冲体系中包含浓度为5‑500mmol/L的L‑色氨酸；(ii)将所述的待测IDO2样品和缓冲体系混合并反应，获得含N‑甲酰犬尿氨酸的反应混合物；(iii)对反应混合物进行终止反应；(iv)对反应混合物进行转化，从而将N‑甲酰犬尿氨酸转化为犬尿氨酸；(v)对反应混合物进行离心，获得上清液；(vi)对上清液进行显色反应，并测定上清液的吸光度；(vii)基于测得的吸光度，判断IDO2的酶活性。

【技术特征摘要】
1.一种非诊断性地检测吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO2)活性的方法，其特征在于，包括步骤：(i)提供一待测IDO2样品，和pH7.2-7.8的缓冲体系，所述缓冲体系中包含浓度为5-500mmol/L的L-色氨酸；(ii)将所述的待测IDO2样品和缓冲体系混合并反应，获得含N-甲酰犬尿氨酸的反应混合物；(iii)对反应混合物进行终止反应；(iv)对反应混合物进行转化，从而将N-甲酰犬尿氨酸转化为犬尿氨酸；(v)对反应混合物进行离心，获得上清液；(vi)对上清液进行显色反应，并测定上清液的吸光度；(vii)基于测得的吸光度，判断IDO2的酶活性。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(v)中，所述离心的离心力为8000-20000g，较佳地为10000-15000g，更佳地为12000-14000g。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(v)中，所述离心的时间为5-20min，较佳地为8-10min。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(i)中，所述IDO2样品包含重组IDO2。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(i)中，所述的缓冲体系还包含浓度为50mmol/L的磷酸缓冲液、浓度为200μg/mL的过氧化氢酶、浓度为40mmol/L的抗坏血酸、和浓度为20μm...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡春香，杨春，李娟娟，
申请(专利权)人：苏州康正生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32