用特异性抗体进行中药成分测定的方法技术

本发明专利技术提出一种无须分离便可直接定性定量测定中药提取液中各种成分的方法。将标准药材中提取的纯－成分作为抗原，与免疫佐剂混合，免疫动物，制备抗已知中药成分特异性抗体制剂，用抗原抗体反应法对待检中药提取液进行检测，依其所发生的抗原抗体反应，标示相应中药成分的定性定量测定结果。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
中草药是我们的国宝，但中药有效成分的定性定量检测问题一直是制约其发展的最大障碍。目前比较先进的测定方法是先用不同物理、化学方法对中药成分进行初步的提取分离，然后再用高效液相层析或薄层扫描等技术进一步分离定量。中药复方制剂由多味中药组成，而单味中药通常含有几十种甚至上百种成分，分离过程异常繁琐，即使用高效液相等方法，确定分离条件也相当艰巨，通常一种成分的分离精制从开始实验到确定最佳方法需数月之久，而且同一成分在不同中药、不同制剂中的分离方法常常是不能通用的。因此制定每种制剂的质量标准都需要从头摸索，必然耗费很大的人力、物力、财力。更严重的问题是，某些成分因结构、性质过于相近，在现有的条件下难以找到合适的分离方法；某些中药如蝉蜕等提取物，用物理、化学方法难于找到其特异性成分。致使某些疗效很好的中药却没有客观的定性定量标准，而无法打入国际市场。本专利技术的目的在于提出一种无须分离便可直接定性定量测定中药提取液中各种成分的方法。用抗中药成分特异性抗体，与中药复方或不同中药材中所含的同一中药成分发生抗原抗体反应，进行定性定量测定。从而为中成药质量控制和药材品质鉴定提供一种简便、快捷、准确的先进方法。这种的技术方案是将标准药材中提取的纯一成分作为抗原，与免疫佐剂混合，免疫动物，制备抗已知中药成分特异性抗体制剂，用抗原抗体反应法对待检中药提取液进行检测，依其所发生的抗原抗体反应，标示相应中药成分的定性定量测定结果。所述的，对于标准中药材中具有免疫原性的成分可直接作抗原；不具有免疫原性的半抗原成分，则通过物理和化学方法与载体连结成完全抗原。所述的中所述制备抗已知中药成分特异性抗体包括制备免疫动物血清多克隆抗体和使用杂交瘤技术制备单克隆抗体。所述的中所述抗已知中药成分特异性抗体制剂形式包括标准抗体制剂、免疫标记的抗体制剂、琼脂扩散标准板、ELISA板及其它免疫诊断学上应用的制剂形式。所述的中所述对待检中药提取液进行检测的方法为抗原抗体反应法，包括单向琼脂扩散法、双向琼脂扩散法、火箭电泳法、对流电泳法、免疫电泳法、免疫荧光标记法、免疫酶标记法、放射免疫测定法及其它抗原抗体反应的方法。所述的中所述免疫佐剂包括完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂。本专利技术的优点是1、有高度特异性；2、敏感性高，可测mg/ml、μg/ml、ng/ml甚至pg/ml水平。3、方法简便、快捷、准确。4、只要制备出抗单一中药成分抗体，不须进行成分分离即可用于所有含有该中药成分药物的定性定量测定，测定结果不受其他成分影响。下面结合实施例进一步说明本专利技术的
技术实现思路
实施例1用抗穿山甲蛋白抗体定性定量测定中药中的相应成分1、抗原制备从穿山甲中提取蛋白质，直接作为抗原。2、制备抗穿山甲蛋白多克隆抗体(1)免疫动物取穿山甲蛋白100-600μg与完全福氏佐剂(石腊油+羊毛脂+卡介苗)1∶1混合，给家兔多点(如足掌、国窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等8-10点)皮下注射进行免疫，间隔7-20天注射1次，共注射5-8次。(2)、制备抗穿山甲蛋白抗体末次注射后5-7天，无菌采血制血清，依次用40％、35％、33％饱和硫酸铵盐析浓缩抗体，即得抗穿山甲蛋白抗体。3、制备抗穿山甲蛋白单克隆抗体(1)、免疫动物取穿山甲蛋白100-200μg与完全福氏佐剂(石腊油+羊毛脂+卡介苗)1∶1混合，进行BALB/c小鼠腹腔初次免疫，间隔3-6周，同法再次加强免疫一次，最后于细胞融合前3-4天单用穿山甲蛋白腹腔免疫。(2)、制备杂交瘤取免疫小鼠，剪颈放血，收集血液，可分离血清测定抗体浓度。将鼠体浸于75％酒精中消毒，然后无菌取脾，制备脾细胞悬液。取其脾细胞与骨髓瘤细胞按2∶1-5∶1比例于50ml塑料离心管内混合，离心1000rpm，10分钟去上清，叩击管底，使其沉淀物混匀呈糊状，置37℃水浴，将预温的50％PEG液滴入0.3-0.5ml(1分钟内滴完，边滴边摇)，静置90秒钟，逐滴加入GKN液15ml(2-4分钟内滴完)以停止PEG作用。离心(1000rpm，10分钟)去上清，依据细胞数量加入HAT培养液，加到96孔培养板，每孔加入0.5-1.5×105，同时加入饲养细胞(小鼠腹腔细胞)2×104，置37℃含5-7％CO2培养箱培养7天，全部吸除HAT培养液，换用HT培养液继续培养。当杂交瘤细胞生长达1/3-1/2培养孔面时，检测抗穿山甲蛋白特异性抗体，及时进行细胞克隆化。(3)、制备抗穿山甲蛋白单克隆抗体选择抗体阳性孔，采用试管连续稀释法，最终使96孔板每孔平均只含一个杂交瘤细胞，培养后即得单细胞克隆。经3-5次反复克隆化后，将高效价抗体阳性杂交瘤细胞株扩大培养。其培养上清液即含有大量抗穿山甲蛋白单克隆抗体。可将杂交瘤细胞株5-10×105接种于BALB/c小鼠腹腔，7-10天即可诱出腹腔肿瘤并产生含有大量抗穿山甲蛋白单克隆抗体的腹水。10-14天可分次采集腹水，每只鼠可得5-20ml腹水(含抗穿山甲蛋白单克隆抗体5-20mg/ml)，将腹水离心去除细胞，经56℃30分钟灭活，即得抗穿山甲蛋白单克隆抗体。腹水依次用40％、35％、33％饱和硫酸铵盐析浓缩，最后可用SPA亲和层析法或DEAE离子交换层析法纯化IgG类抗穿山甲蛋白单克隆抗体。也可用Sephadex G-200、Sephacryl S300或凝集素亲和层析法纯化IgM类抗穿山甲蛋白单克隆抗体。4、穿山甲蛋白定量测定(1)、单向琼脂扩散法用巴比妥缓冲液1000ml琼脂10g加热至100℃使其溶解，冷却至50℃左右定量加入抗穿山甲蛋白抗体，混匀，注成平板，凝固后间隔15mm打孔、孔径约3mm，各孔分别加入不等量标准穿山甲蛋白，置室温或37℃24-48小时，测量沉淀环直径。穿山甲蛋白含量(C)与沉淀环直径(D)呈线性关系，可依C/D2=K制标准曲线图(Mancini曲线)，还可将其制成标准板，用于测定所有含穿山甲蛋白的中药复方制剂。即将中药复方制剂提取液加入孔内，同上24-48小时测量沉淀环直径，查Mancini曲线，即可得知穿山甲蛋白含量值。本法可测到mg/ml、μg/ml以上抗原含量。(2)、火箭电泳本法由单向琼脂扩散法发展而来，只是将其放入电场中加快扩散速度、缩短时间、提高敏感度。用巴比妥缓冲液1000ml琼脂10克加热至100℃使其溶解，冷却至50℃左右定量加入抗穿山甲蛋白抗体，混匀，注成平板，凝固后打两排孔，孔径3mm，孔距5mm，第一排距琼脂板端1cm，第二排距第一排4-6cm。各孔分别加入不同浓度标准穿山甲蛋白或含穿山甲蛋白的中药制剂提取液，立即开始电泳，电泳2-4小时，精确测量沉淀峰高度，峰形高度与抗原含量呈正比。以不同浓度标准穿山甲蛋白孔的沉淀峰高度作标准曲线，测量中药制剂孔沉淀峰高度，查标准曲线，即得中药制剂提取液中穿山甲蛋白的含量。可测μg/ml以上抗原含量。如果抗原含量过低，可用少量I125标记标准抗原与被检抗原共同电泳，干燥后用X线胶片显影，可测ng/ml水平。(3)、ELISA抗原竞争法用抗穿山甲蛋白抗体标准化包被ELISA板；用辣根过氧化物酶标记标准穿山甲蛋白；实验分三组，即含穿山甲蛋白中药复方制剂提取液组、含穿山甲蛋白中药复方制剂提取液与一定量的酶标标准穿山甲蛋白混合组、酶标标准穿山甲蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
用特异性抗体进行中药成分测定的方法，其特征在于将标准药材中提取的纯－成分作为抗原，与免疫佐剂混合，免疫动物，制备抗已知中药成分特异性抗体制剂，用抗原抗体反应法对待检中药提取液进行检测，标示相应中药成分的定性定量测定结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文泰，李丽华，刘庆海，
申请(专利权)人：刘文泰，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]