本发明专利技术涉及鼻咽癌诊断设备。公开了一种鼻咽癌血清学诊断试剂盒，其组成为：（１）ＥＢＶ－ＥＡ复合蛋白包被的９６孔板１块；（２）样品稀释液１００人份；（３）辣根过氧化物酶标记的羊抗人ＩｇＧ使用液１００人份；（４）显色液：Ａ液（０．０４％联苯二胺）１００人份；Ｂ液（０．０１５％过氧化氢）１００人份；（５）终止液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸）１００人份；（６）阳性对照：鼻咽癌患者混合血清１ｍｌ；（７）阴性对照：健康人混合血清１ｍｌ；（８）２５倍浓缩的洗涤液５０ｍｌ。本发明专利技术的鼻咽癌血清学诊断试剂盒性价比高、应用时不必稀释血清，省时、高效、易于推广应用，特别适用于高发区人群的鼻咽癌血清学筛查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鼻咽癌诊断设备，特别涉及一种鼻咽癌血清学诊断试剂盒。
技术介绍
由于鼻咽癌患者与健康人血清之间EB病毒(Epstein barr virus，EBV)相关抗体的种类及含量高低存在着差别。应用间接免疫酶方法测定血清EB病毒抗体IgA水平作为鼻咽癌的辅助诊断手段已沿用了近三十年，检查结果主要依赖显微镜观察进行主观判断。为了对这一方法进行改进，应用基因工程方法生产了各种EB病毒相关的抗原如核抗原(EBNAs)、即刻早期蛋白抗原(ZEBRA)、弥散型早期抗原(EA-D)、衣壳抗原(VCA)、膜抗原(MA)等。应用上述抗原的组合已建立了检测血清中相应IgA或IgG抗体水平的酶联吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)方法，发挥了ELISA方法可利用仪器读数，使结果判断更为客观，操作也更简便的特点。部分试剂盒已作为商品提供临床应用。用不同的EBV相关抗原来区别鼻咽癌患者血清与健康人之间的差异，涉及到各种EBV相关抗原的制备，纯化及抗原的优化组合等问题，是现有试剂盒成本高的原因之一。由于价格高，目前市场提供的ELISA试剂盒在鼻咽癌高发现场监测中难于推广应用。要将ELISA方法推广到鼻咽癌高发现场应用就必须提高ELISA试剂盒的性价比。在不影响检测效果的条件下更经济地制备EB病毒相关抗原是提高试剂盒性价比的重要途经之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种性价比高、易于推广应用的鼻咽癌血清学诊断试剂盒。本专利技术的目的是这样实现的该鼻咽癌血清学诊断试剂盒组成为(1)EBV早期复合蛋白(EB-EAc)包被的96孔板1块；(2)样品稀释液 100人份；(3)辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG使用液100人份；(4)显色液 A液0.04％联苯二胺 100人份；B液0.015％过氧化氢 100人份；(5)终止液 2mol/L硫酸 100人份；(6)阳性对照鼻咽癌患者混合血清 1mL；(7)阴性对照健康人混合血清 1mL；(8)25倍浓缩的洗涤液0.2M pH7.0磷酸盐缓冲液 50mL。与现有技术相比较，本专利技术以经过处理的含EB病毒早期复合蛋白(EBV-EAc)的细胞蛋白作为ELISA包被抗原检测各类血清，其准确性(判断鼻咽癌的敏感性与特异性之和)高于当前的市售试剂盒。在检测鼻咽癌血清方面本试剂盒与检测血清VCA-IgA或EA-IgA抗体的间接酶方法，检测血清EBV-DNA酶抗体的中和法有互补性，其中与VCA-IgA方法存在更明显的互补，二者联合应用可提高鼻咽癌检出率。将本试剂盒用于鼻咽癌血清学筛查时，可先用本试剂盒检测血清的EAc-IgG抗体水平，阳性者再用间接酶方法测VCA-IgA滴度，将具有双项阳性者作为判断高危人群的标准进行临床检查或随访，能提高早期鼻咽癌的检出率。这种联合筛查方法经实践检验是目前可应用于高发地区鼻咽癌血清学筛查的最快捷最经济的途径。本试剂盒的待测血清只作对倍稀释，即先在反应孔中加入50微升样品稀释液后再加入50微升血清原液即可进行实验，不须另外稀释待测血清，检测时间仅需2小时，既减少了检测误差，又节省了工时，在操作方面具有显著的独特性。附图说明图1是本专利技术的EBV-EAc抗原与各类血清的反应结果测试图。具体实施例方式本专利技术采用一种抗原提取液处理能表达EBV-EAc的Raji细胞，然后应用免疫吸附方法去除与健康人有反应的蛋白成份。建立了直接应用含有EBV-EAc细胞蛋白作为ELISA抗原的鼻咽癌血清学诊断试剂盒。该试剂盒组成为(1)EBV早期复合蛋白(EB-EAc)包被的96孔板1块；(2)样品稀释液 100人份(0.05ml/人)；(3)辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG使用液100人份(0.1ml/人)；(4)显色液 A液0.04％联苯二胺 100人份(0.05ml/人)；B液0.015％过氧化氢 100人份(0.05ml/人)；(5)终止液 2mol/L硫酸 100人份(0.1ml/人)；(6)阳性对照鼻咽癌患者混合血清 1mL；(7)阴性对照健康人混合血清 1mL；(8)25倍浓缩的洗涤液0.2M pH7.0磷酸盐(P.B.S)缓冲液50mL。根据ELISA操作步骤用这个试剂盒检测血清可以诊断鼻咽癌。操作过程简述如下将健康人血清、鼻咽癌患者血清、其它肿瘤患者血清、现场筛查血清和试剂盒内的阳性、阴性血清各0.05mL加到反应板上(1人/孔)。依常规ELISA方法温育、洗涤(将试剂盒内备好洗涤液进行25倍稀释后应用)三次、每孔再加入试剂盒内备好的二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG使用液，温育、洗涤后每孔分别加入显色液A和B各0.05mL显色10分钟后加入终止液0.1mL。将反应孔的颜色与阳性对照孔作对比，或用酶标读数仪进行检测，待检血清孔吸光度A与阴性对照孔吸光度A之比＞2.1时，该孔血清的IgG抗EBV-Eac为阳性，可作为判断鼻咽癌的标准。一、材料与方法材料1.反应板内抗原的制备表达EBV-EAc的含EBV基因组的细胞(通常为正丁酸诱导后的RaJi细胞)，悬浮于10倍于细胞压积的抗原提取液(主要成份Tris-HCL缓冲液、氯化镁、氯化钾和巯基乙醇)中，-20℃过夜，室温解冻，超声粉碎机处理细胞悬液，10000rpm4℃离心10分钟，取上清液用健康人IgG琼脂糖珠吸附3次后，测定蛋白浓度，-80℃保存作为ELISA抗原。以0.1μg/孔浓度包被96孔酶标反应板。2.待测血清健康人血清、鼻咽癌患者血清、其它肿瘤患者血清和现场筛查血清每例1mL。3.二抗、显色液、终止液和洗涤液与试剂盒内所列相同方法1.应用免疫印迹方法了解制备的EBV-EAc抗原与各类血清的反应；2.应用本试剂盒对待检血清进行ELISA检测以了解(1)本试剂盒检测鼻咽癌血清的敏感性和特异性；(2)本试剂与现有方法(EA-IgA、VCA-IgA间接酶法和DNA酶中和法)对各类血清进行平行测定结果；(3)本试剂与现有方法(EA-IgA、VCA-IgA间接酶法和DNA酶中和法)在检测鼻咽癌血清中的互补性；(4)本试剂与市售的3种EBV-ELISA试剂盒的平行测定结果；(5)本试剂在高危人群血清学筛查中的应用。二、结果1.EBV-EAc抗原与各类血清的反应EA抗原为复合物，在图1中，1、2为EAc细胞蛋白SDS-PAGE考马氏亮蓝染色，3、4、5、6为western blot图，3、5与鼻咽癌血清反应，4与正常人血清反应，6为未诱导的Raji细胞蛋白与鼻咽癌血清呈阴性反应。2.用本试剂盒检测各种血清的结果应用酶标仪在波长490/630下测定各组的光密度A均值分组 A均值NPC(266例) 0.488(P)非NPC肿瘤(286例) 0.195健康人群(347例) 0.159(N)P/N＞2.1EAc-IgG阳性率 (Cutoff A值＝0.3)分组 阳性人数NPC(266) 248/266(93.23％)非NPC肿瘤(286) 43/286(15.03％)健康人群(347) 4/347(6.92％)即特异性93.08％(323/347)敏感性93.23％(248/266) 3.本试剂与EA-IgA，VCA-IgA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鼻咽癌血清学诊断试剂盒，其组成为：（１）ＥＢＶ－ＥＡｃ蛋白包被的９６孔板１块；（２）样品稀释液１００人份；（３）辣根过氧化物酶标记的羊抗人ＩｇＧ使用液１００人份；（４）显色液：Ａ液：０．０４％联苯二胺１００人份；Ｂ液：０．０１５％过氧化氢１００人份；（５）终止液：２ｍｏｌ／Ｌ硫酸１００人份；（６）阳性对照：鼻咽癌患者混合血清１ｍＬ；（７）阴性对照：健康人混合血清１ｍＬ；（８）２５倍浓缩的洗涤液：０．２ＭｐＨ７．０磷酸盐缓冲液５０ｍＬ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张昌卿，肖锡宾，孙韵，张颖，叶永照，洪明晃，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心，
类型：发明
国别省市：81[]
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