本发明专利技术公开了一种快速检测工业食品中单增李斯特菌的LAMP试剂盒，由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有Bst?DNA聚合酶大片段、引物、LAMP10×buffer、dNTPs溶液、MgSO4溶液和甜菜碱。引物分为正向引物和反向引物。本发明专利技术具有特异性好，灵敏度高，快速简便，可重复性高以及肉眼可判断结果等优点，可对工业食品中单增李斯特菌进行快速定性检测，可替代一直沿用的传统的培养法和血清学诊断方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种快速检测单增李斯特菌的LAMP试剂盒，属于食品检测领域。
技术介绍
单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种人畜共患病的病原菌,它广泛存在于自然界中。该菌在4°C的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。食品中存在的单增李斯特菌威胁着人类的健康，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。近年来发展起来的环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因定性检测方面得 到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定性检测的重要方法之一。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是一种新型等温核酸扩增方法，该法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件(65°C左右)保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。该技术具有不需要PCR仪、扩增产物不需要开盖，用肉眼即可判断结果及反应时间短，特异性强，灵敏度高等优点。传统检测单增李斯特菌的方法，需要分离、筛选和生化鉴定，必要时还需要血清学鉴定，一般为4 6d，费时费力，具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点。各种常规PCR方法具有敏感性强、特异性高、简便、快速等优点，有较多应用于单增李斯特菌检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。因此隳待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术存在的不足，提供一种快速检测单增李斯特菌的LAMP试剂盒及其使用方法。本专利技术提供一种快速检测单增李斯特菌的LAMP试剂盒，试剂盒包括a) LAMP反应液，b)标准阳性模板，c)阴性质控标准品；LAMP反应液含有引物，引物为以下5组特异性引物中的任意一组(I)上游外引物 F3 :5' -TGTTACTAAAGAGCAGTTGC-3' ; (SEQ ID No. I)下游外引物B3:5' -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3' ；(SEQ ID No. 2)上游内引物FIP :5' TAAACTTGACGGCCATACGCCGCTTGGAGTGAATGCAGAA-3' ; (SEQ IDNo. 3)下游内引物BIP V -CTGCTTTTGATGCTGCCGTATATTTGTTAGTTCTACATCACCTGA-3' ；(SEQ ID No. 4)(2)上游外引物 F3 :5' -GAACCTACAAGACCTTCCA-3' ; (SEQ ID No. 5)下游外引物B3 :5' -AGATTTTCCGCTTACGGC-3' ; (SEQ ID No. 6 )上游内引物FIP 5 ' GGATTTTCTGCATTCACTCCAAGCGATTTTTCGGCAAAGCTGT-3 '；(SEQ ID No. 7)下游内引物BIP :5'-TCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT-3/ ；(SEQ IDNo. 8)(3)上游外引物 F3 :5' -GAACCTACAAGACCTTCCA-3' ; (SEQ ID No. 9)下游外引物B3:5' -AGATTTTCCGCTTACGGC-3' ; (SEQ ID No. 10)上游内引物FIP :5'-GGATTTTCTGCATTCACTCCAAGCGATTTTTCGGCAAAGCTGTT-3/ ；(SEQ ID No. 11)下游内引物BIP :5'-TCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT-3' ；(SEQ IDNo. 12)(4)上游外引物 F3 :5' -GCTGTTACTAAAGAGCAGTTG-3' ; (SEQ ID No. 13)下游外引物B3 :5' -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3' ; (SEQ ID No. 14)上游内引物FI P 5/ GCCATACGCCACACTTGAGACAAGCGCTTGGAGTGAAT-3' ; (SEQ IDNo. 15)下游内引物BIP :5'-AAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGGTTAGTTCTACATCACCTGAGAC-3/ ；(SEQ ID No. 16)(5)上游外引物 F3 :5' -TGTTACTAAAGAGCAGTTGC-3' ; (SEQ ID No. 17)下游外引物B3 :5' -TTACGGCTTTGAAGGAAGA-3' ; (SEQ ID No. 18)上游内引物FIP :5 ' -TAAACTTGACGGCCATACGCCGGAGTGAATGCAGAAAATCCT-3 '；(SEQ ID No. 19)下游内引物BIP :5'-AAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGGTTAGTTCTACATCACCTGAGAC-3/。(SEQ ID No. 20)具体地说，a) LAMP 反应液LAMP反应液是由Bst DNA聚合酶大片段、LAMP 10 X buffer、10 μ mol/L的夕卜引物和内引物、5mol/L舌甘菜碱、50mmol/L MgSO4和10mmol/L dNTPs组成。在本专利技术的一个具体方案中，LAMP反应液由LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，10 μ mol/L内引物FIP、BIP 各 2· 0 μ 1，10 μ mol/L 夕卜引物 F3、B3 各 I. O μ 1，IOmmoI/L dNTPs3. O μ 1，50mmol/LMgS043. 0 μ 1,5. OmoI/L甜菜碱4. 5 μ I, Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I组成，反应液总体积20 μ I。b)标准阳性模板标准阳性模板是含有单增李斯特菌高度保守基因hlyA基因356个碱基对的核苷酸片段构成的pMD18-T_hlyA载体，该载体可在大肠杆菌DH5 α中增殖。hlyA基因的核苷酸序列为5 ' -TAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCGTAAGCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGCAACCTCGGAGACTTACGCGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测单增李斯特菌的LAMP试剂盒，其特征在于,试剂盒包括：a)LAMP反应液，b)标准阳性模板，c)阴性质控标准品；所述LAMP反应液含有引物，引物为以下5组特异性引物中的任意一组:（1）上游外引物F3：5′？TGTTACTAAAGAGCAGTTGC？3′；下游外引物B3：5′？TTACGGCTTTGAAGGAAGA？3′；上游内引物FIP：5′TAAACTTGACGGCCATACGCCGCTTGGAGTGAATGCAGAA？3′；下游内引物BIP：5′？CTGCTTTTGATGCTGCCGTATATTTGTTAGTTCTACATCACCTGA？3′；（2）上游外引物F3：5′？GAACCTACAAGACCTTCCA？3′；下游外引物B3：5′？AGATTTTCCGCTTACGGC？3′；上游内引物FIP：5′GGATTTTCTGCATTCACTCCAAGCGATTTTTCGGCAAAGCTGT？3′；下游内引物BIP：5′？TCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT？3′；（3）上游外引物F3：5′？GAACCTACAAGACCTTCCA？3′；下游外引物B3：5′？AGATTTTCCGCTTACGGC？3′；上游内引物FIP：5′？GGATTTTCTGCATTCACTCCAAGCGATTTTTCGGCAAAGCTGTT？3′；下游内引物BIP：5′？TCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT？3′；（4）上游外引物F3：5′？GCTGTTACTAAAGAGCAGTTG？3′；下游外引物B3：5′？TTACGGCTTTGAAGGAAGA？3′；上游内引物FIP：5′GCCATACGCCACACTTGAGACAAGCGCTTGGAGTGAAT？3′；下游内引物BIP：5′？AAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGGTTAGTTCTACATCACCTGAGAC？3′；（5）上游外引物F3：5′？TGTTACTAAAGAGCAGTTGC？3′；下游外引物B3：5′？TTACGGCTTTGAAGGAAGA？3′；上游内引物FIP：5′？TAAACTTGACGGCCATACGCCGGAGTGAATGCAGAAAATCCT？3′；下游内引物BIP：5′？AAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGGTTAGTTCTACATCACCTGAGAC？3′。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王业富，郑虎，卢晅，
申请(专利权)人：武汉真福医药科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：
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