快速检测志贺氏菌的LAMP试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种快速检测志贺氏菌的LAMP试剂盒，由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有Bst?DNA聚合酶大片段、引物、LAMP10×buffer、dNTPs溶液、MgSO4溶液和甜菜碱。引物分为正向引物和反向引物。本发明专利技术具有特异性好，灵敏度高，快速简便，可重复性高以及肉眼可判断结果等优点，可对工业食品中志贺氏菌进行快速定性检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和血清学诊断方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速检测志贺氏菌的LAMP试剂盒，属于食品检测领域。
技术介绍
志贺氏菌属(ShigellaCastellani and Chalmers)是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。细菌性痢疾是最常见的肠道传染病，夏秋两季患者最多。传染源主要为病人和带菌者，通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染。人类对志贺氏菌易感，10 200个细菌可使10 50%志愿者致病。一般说来，志贺氏菌所致菌痢的病情较重。急性细菌性痢疾多见于小儿，各型痢疾杆菌都可引起。发病急，常在腹痛、腹泻未出现，呈现严重的全身中毒症状。急性菌痢治疗不彻底，或机体抵抗力低、营养不良或伴有其他慢性病时，易转为慢性。病程多在二个月以上，迁延不愈或时愈时发。 近年来发展起来的环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因定性检测方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定性检测的重要方法之一。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是一种新型等温核酸扩增方法，该法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件(65°C左右)保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。该技术具有不需要PCR仪、扩增产物不需要开盖，用肉眼即可判断结果及反应时间短，特异性强，灵敏度高等优点。传统检测志贺氏菌的培养方法，需要分离、筛选和生化鉴定，必要时还需要血清学鉴定，一般为4 6d，费时费力，具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点。各种常规PCR方法具有敏感性强、特异性高、简便、快速等优点，有较多应用于志贺氏菌检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。因此隳待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术存在的不足，提供一种快速检测志贺氏菌的LAMP试剂盒及其使用方法。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种快速检测志贺氏菌的LAMP试剂盒，该试剂盒包括a) LAMP反应液，b)标准阳性模板，c)阴性质控标准品；LAMP反应液含有引物，引物为以下4组特异性引物中的任意一组(I)上游外引物 F3 :5' -TCTGGAGGACATTGCCCG-3' ; (SEQ ID No. I)下游外引物B3:5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3' ；(SEQ ID No. 2)上游内引物FIP :5'-GCATGGTCTGGAAGGCCAGGAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGG-3' ；(SEQ ID No. 3)下游内引物BIP :5' -TCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCCGGAGGTCATTTGCTGTCAC-3 '；(SEQ ID No. 4)(2)上游外引物 F3 :5' -GGCAGGGAAATGTTCCGC-3' ; (SEQ ID No. 5)下游外引物B3 :5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3' ; (SEQ ID No. 6 )上游内引物FIP : 5 ' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG-3 ' ; (SEQID No. 7)下游内引物BIP :5 ' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTGCTGTCACTCCCGACAC-3 ' ; (SEQID No. 8) (3)上游外引物 F3 :5' -GCAGGGAAATGTTCCGCC-3' ; (SEQ ID No. 9)下游外引物B3 :5' -CTTCTGACCATGGCTTCGG-3' ；(SEQ IDNo. 10)上游内引物FIP : 5' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTGAGGACATTGCCCGGGATA-3' ; (SEQID No. 11)下游内引物BIP 5 ' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTAGGTCATTTGCTGTCACTCC-3 '；(SEQ ID No. 12)(4)上游外引物 F3 :5' -CGCCTCGAAATTCTGGAGG-3' ; (SEQ ID No. 13)下游外引物B3 :5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3' ; (SEQ ID No. 14)上游内引物FIP :5 ' -GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTACATTGCCCGGGATAAAGTC-3 '；(SEQ ID No. 15)下游内引物BIP :5 ' -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTGCTGTCACTCCCGACAC-3 ' ; (SEQID No. 16)具体地说，a) LAMP 反应液LAMP反应液由Bst DNA聚合酶大片段、LAMPlO Xbuffer、10 μ mol/L的外引物、10 μ mol/L 的内引物、5mol/L 甜菜喊、50mmol/L MgSO4 和 10mmol /T, dNTPs 组成。在本专利技术的一个具体方案中，LAMP反应液由LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，10 μ mol/L 内弓 I 物 FIP、BIP 各 2· O μ 1，10 μ mol/L 夕卜引物 F3、B3 各 I. O μ 1，IOmmoI/LdNTPs3. 0μ I, 50mmol/L MgS043. 0 μ 1，5. Omol/L 甜菜碱 4· 5 μ 1，Bst DNA 聚合酶大片段I. O μ I组成,反应液总体积20 μ I。b)标准阳性模板标准阳性模板是含有志贺氏菌高度保守基因ipaH基因351个碱基对的核苷酸片段构成的pMD18-T_ipaH载体，该载体可在大肠杆菌DH5 α中增殖。ipaH基因的核苷酸序列为5 ' -CTCACATGGAACAATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTCCATCAGGCATCTGAAGGCCTTTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGCCGTGAAGAGAATGAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGGGGACCA-3' (SEQ ID No. 17)实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pMD18-T_ipaH，该质粒转化大肠杆菌DH5 α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，_20°C保存。c)阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测志贺氏菌的LAMP试剂盒，其特征在于，由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有引物，引物为以下4组特异性引物中的任意一组:（1）上游外引物F3：5′？TCTGGAGGACATTGCCCG？3′；下游外引物B3：5′？GCTTCTGACCATGGCTTCG？3′；上游内引物FIP：5′？GCATGGTCTGGAAGGCCAGGAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGG？3′；下游内引物BIP：5′？TCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCCGGAGGTCATTTGCTGTCAC？3′；（2）上游外引物F3：5′？GGCAGGGAAATGTTCCGC？3′；下游外引物B3：5′？GCTTCTGACCATGGCTTCG？3′；上游内引物FIP：5′？GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG？3′；下游内引物BIP：5′？TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTGCTGTCACTCCCGACAC？3′；（3）上游外引物F3：5′？GCAGGGAAATGTTCCGCC？3′；下游外引物B3：5′？CTTCTGACCATGGCTTCGG？3′；上游内引物FIP：5′？GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTGAGGACATTGCCCGGGATA？3′；下游内引物BIP：5′？TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTAGGTCATTTGCTGTCACTCC？3′；（4）上游外引物F3：5′？CGCCTCGAAATTCTGGAGG？3′；下游外引物B3：5′？GCTTCTGACCATGGCTTCG？3′；上游内引物FIP：5′？GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTACATTGCCCGGGATAAAGTC？3′；下游内引物BIP：5′？TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTGCTGTCACTCCCGACAC？3′。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王业富，郑虎，卢晅，
申请(专利权)人：武汉真福医药科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：