本发明专利技术公开了一种快速检测空肠弯曲菌的LAMP试剂盒，由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有Bst?DNA聚合酶大片段、引物、LAMP10×buffer、dNTPs溶液、MgSO4溶液和甜菜碱。引物分为正向引物和反向引物。本发明专利技术具有特异性好，灵敏度高，快速简便，可重复性高以及肉眼可判断结果等优点，可对工业食品中空肠弯曲菌进行快速定性检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和血清学诊断方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种快速检测空肠弯曲菌的LAMP剂盒，属于食品检测领域。
技术介绍
空肠弯曲菌(c. jejuni)菌体轻度弯曲似逗点状，长I. 5 5 μ m，宽O. 2 O. 8 μ m。菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。微需氧菌，在含2. 5 5%氧和10%C02的环境中生长最好。最适温度为37 42°C。在正常大气或无氧环境中均不能生长。空肠弯曲茵是一种人畜共患病病原茵，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食物源性病原茵，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。空肠弯曲菌有内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒。潜伏期一般为3 5天，对人的致病部位是空肠、回肠及结肠。主要症状为腹 泻和腹痛，有时发热，偶有呕吐和脱水。因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。近年来发展起来的环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因定性检测方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定性检测的重要方法之一。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是一种新型等温核酸扩增方法，该法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件(65°C左右)保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。该技术具有不需要PCR仪、扩增产物不需要开盖，用肉眼即可判断结果及反应时间短，特异性强，灵敏度高等优点。传统检测空肠弯曲菌的培养方法，需要分离、筛选和生化鉴定，必要时还需要血清学鉴定，一般为4 6d，费时费力，具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点。各种常规PCR方法具有敏感性强、特异性高、简便、快速等优点，有较多应用于空肠弯曲菌检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。因此隳待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术存在的不足，提供一种快速检测空肠弯曲菌的LAMP试剂盒及其使用方法。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种快速检测空肠弯曲菌的LAMP试剂盒，该试剂盒包括a) LAMP反应液，b)标准阳性模板，c)阴性质控标准品；LAMP反应液含有引物，引物为以下5组特异性引物中的任意一组(I)上游外引物 F3 :5' -TGTAATGCATGCTTGCGG-3' ; (SEQ ID No. I)下游外引物B3:5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3' ；(SEQ ID No. 2)上游内引物FIP :5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTTCATGATGGACATACTACTTCT-3/ ；(SEQ ID No. 3)下游内引物BIP V -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3/ ；(SEQ ID No. 4)(2)上游外引物 F3 :5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3' ; (SEQ ID No. 5)下游外引物B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3' ; (SEQ ID No. 6 )上游内引物FIP : 5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTGATGGACATACTACTTCTTTATTGC-3'；(SEQ ID No. 7)下游内引物BIP :5' -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'；(SEQ ID No. 8)(3 )上游外引物 F3 :5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3' ; (SEQ ID No. 9 )下游外引物B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3' ; (SEQ ID No. 10)上游内引物FIP :5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTATGGACATACTACTTCTTTATTGC-3'；(SEQ ID No. 11)下游内引物BIP :5' -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'；(SEQ ID No. 12)(4)上游外引物 F3 :5' -TAATGCATGCTTGCGGTC-3; ; (SEQ ID No. 13)下游外引物B3 :5' -GCCATCCAAAAACATAATCACT-3' ; (SEQ ID No. 14)上游内引物FIP :5' -AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTATGGACATACTACTTCTTTATTGCT-3'；(SEQ ID No. 15)下游内引物BIP :5' -TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG-3'；(SEQ ID No. 16)(5)上游外引物 F3 :5' -GCAAAGTATTTAGCAAGTCAGAA-3' ; (SEQ ID No. 17)下游外引物B3 :5' -ACTTCAATGCTATAACTATCCG-3' ; (SEQ ID No. 18)上游内引物FIP :5' -CATTGCCTTAGCACCACCCAGGCACTCTAAATCTTTATTTTCAAC-3' ;(SEQ ID No. 19)下游内引物BIP :5' -AGTGATTATGTTTTTGGATGGCACAAAGAAGCCATCATCGCAC-3'；(SEQ ID No. 20)具体地说，a) LAMP 反应液LAMP反应液由Bst DNA聚合酶大片段、LAMPlO Xbuffer、10 μ mol/L的外引物、10 μ mol/L 的内引物、5mol/L 甜菜碱、50mmol/L MgSO4 和 IOmmoI/L dNTPs 组成。在本专利技术的一个具体方案中，LAMP反应液由LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，10 μ mol/L内引物FIP、BIP各 2· 0 μ1，10 μ mol/L 外引物 F3、Β3 各 L O μ 1，IOmmoI/L dNTPs3. 0 μ 1，50mmol/L MgSO43.0μ 1，5. Omol/L甜菜碱4. 5μ l，Bst DNA聚合酶大片段I. 0 μ I组成，反应液总体积20 μ I。b)标准阳性模板标准阳性模板是含有空肠弯曲菌高度保守基因hipO基因314个碱基对的核苷酸片段构成的pMD18-T-hip0载体，该载体可在大肠杆菌DH5 α中增殖。hipO基因的核苷酸序列为5 ' -CCTTATAAAAGCAAAAAAGAAAATGTAATGCATGCTTGCGGTCATGATGGACATACTACTTCTTTATTGCTTGCTGCAAAGTATTTAGCAAGTCAGAATTTTAATGGTACTCTAAATCTTTA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测空肠弯曲菌的LAMP试剂盒，其特征在于：由LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品组成；LAMP反应液含有引物，引物为以下5组特异性引物中的任意一组:（1）上游外引物F3：5′？TGTAATGCATGCTTGCGG？3′；下游外引物B3：5′？GCCATCCAAAAACATAATCACT？3′；上游内引物FIP：5′？AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTTCATGATGGACATACTACTTCT？3′；下游内引物BIP：5′？TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG？3′；（2）上游外引物F3：5′？TAATGCATGCTTGCGGTC？3′；下游外引物B3：5′？GCCATCCAAAAACATAATCACT？3′；上游内引物FIP：5′？AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTGATGGACATACTACTTCTTTATTGC？3′；下游内引物BIP：5′TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG？3′；（3）上游外引物F3：5′？TAATGCATGCTTGCGGTC？3′；下游外引物B3：5′？GCCATCCAAAAACATAATCACT？3′；上游内引物FIP：5′？AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTATGGACATACTACTTCTTTATTGC？3′；下游内引物BIP：5′TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG？3′；（4）上游外引物F3：5′？TAATGCATGCTTGCGGTC？3′；下游外引物B3：5′？GCCATCCAAAAACATAATCACT？3′；上游内引物FIP：5′？AGTGCCATTAAAATTCTGACTTGCTATGGACATACTACTTCTTTATTGCT？3′；下游内引物BIP：5′TTCAACCTGCTGAAGAGGGTCAAACAATCCATCTTCTATCATTG？3′；（5）上游外引物F3：5′？GCAAAGTATTTAGCAAGTCAGAA？3′；下游外引物B3：5′？ACTTCAATGCTATAACTATCCG？3′；上游内引物FIP：5′？CATTGCCTTAGCACCACCCAGGCACTCTAAATCTTTATTTTCAAC？3′；下游内引物BIP：5′？AGTGATTATGTTTTTGGATGGCACAAAGAAGCCATCATCGCAC？3′。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王业富，郑虎，卢晅，
申请(专利权)人：武汉真福医药科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：
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