抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途。用提纯的香石竹斑驳病毒免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ鼠脾细胞与ＳＰ２／０鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆，获得５株能稳定传代并分泌抗ＣａｒＭＶ单克隆抗体（ＭＡｂ）的杂交瘤细胞，并分别制备它们的单抗腹水。５株单克隆抗体腹水间接ＥＬＩＳＡ效价在１０↑［－６］以上，３Ｇ１、１Ｂ９、２Ａ９和２Ｆ８的单克隆抗体类型及亚类均为ＩｇＧ１，２Ｆ２的单克隆抗体类型及亚类为ＩｇＧ３。５株单抗与ＣａｒＭＶ有特异反应，而与其他病毒无交叉反应。利用这些单抗建立了对检测ＣａｒＭＶ有高度特异性、灵敏性和正确性的ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ、ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ、和ＴＡＳ－ＥＬＩＳＡ方法。本发明专利技术提供的香石竹斑驳病毒的单克隆抗体为ＣａｒＭＶ的快速检测诊断、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该植物病毒病的防治打下基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术所属的领域为生物
，尤其是涉及一种抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途。
技术介绍
香石竹，又称康乃馨，是世界上四大鲜切花之一，也是我国主要的鲜切花(我国香石竹栽培发展很快，年产鲜切花达10亿枝以上)。但香石竹病毒广泛发生于世界香石竹栽培地区，引起香石竹品种退化，长势衰弱，植株畸形，花叶、花条变小，花碎色，叶茎和花出现枯斑，产量和品质下降，降低观赏价值和经济价值。发现感染香石竹的病毒有10多种，其中香石竹斑驳病毒(CarMV)是最主要的病毒之一。香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus，CarMV)是属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)，麝香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)的典型成员，病毒粒子呈正二十面体，直径28-33nm。Guilley等(1985)和Carrington等(1984)报道表明，CarMV基因组为单组分单链正义RNA，含4003nt，包括4个ORF，其中ORF2和ORF3与ORF1具有共同的起始位点，分别为一次通读区和双重通读区，ORF4编码38KD的外壳蛋白。CarMV依靠汁液摩擦传播，能侵染香石竹、中国石竹、甜石竹、苋色藜、菠菜、千日红等多种植物。CaMV在我国上海、北京、昆明等香石竹产地广泛流行，发病严重，因而迫切需要建立快速、准确、简单方便的检测方法，为该病毒病的诊断和防治，脱毒种苗的生产提供技术支撑和物质支持。目前，已报道的CarMV的检测方法有电镜观测和多抗组合成的血清学检测方法两种，但电镜观测法需要昂贵的电子显微镜而不能普及，多抗组合成的血清学检测方法由于多抗存在非特异性高、准确性和均质性差、产量有限等缺陷而使这些血清学方法存在不足，本研究运用我们研制的CarMV特异性单克隆抗体具有特异性强、均质性好、可无限量生产等优点从而使用该单抗建立的ELISA血清学方法具有准确性强、易标准化和大规模生等特点。此方法已有效地用于CarMV在田间作物上的检测，为该病毒病的诊断和防治，脱毒种苗的生产服务。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体及其用途。抗香石竹斑驳病毒(CarMV)的单克隆抗体是3G1、1B9、2A9、2F8、2F25株单克隆抗体腹水的间接ELISA效价在10-6以上；3G1、1B9、2A9、2F8的单克隆抗体类型及亚类均为IgG1，2F2的单克隆抗体类型及亚类为IgG3；5株单抗分别识别CarMV病毒上5个不同的位点；5株单抗均与CarMV有特异反应，而与其他病毒无交叉反应。所述单克隆抗体建立的ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA方法检测抗香石竹斑驳病毒。本专利技术的优点是1)提供的CarMV病毒特异性单克隆抗体，运用ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA能够高度特异、准确、灵敏的检测CarMV；2)利用本专利技术所制备的单克隆抗体检测CarMV，不需要昂贵的电子显微镜设备；3)利用本专利技术所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物CarMV的检测。具体实施例方式本专利技术制备了CarMV的特异性强、效价高、稳定性好、能大量生产的单克隆抗体，并用这些单抗建立了检测CarMV具有高度特异性、灵敏性和正确性的快速诊断方法-ELISA，可为香石竹种苗脱毒鉴定和抗病育种提供有力的技术和产品支持，对该病毒病的综合防治及增产保收提供直接的理论依据和技术保障，同时，可应用于进出口检验，检疫及CarMV疫情调查分析等方面。单克隆抗体的制备1.免疫原的制备将CarMV分离物接种于中国石竹，15d后采集病叶，用10％PEG离心沉淀和蔗糖不连续密度梯度方法提取CarMV。病毒提纯液经2％磷钨酸(pH6.7)染色后置JEOL，JEM-1200EX电镜下观察粒子形态。2.免疫动物用提取CarMV病毒免疫四周龄体重18-20g BALB/C雌性小鼠1mg/ml提取CarMV病毒0.5ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。3.细胞融合取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50％PEG(Sigma)作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养器皿中培养。4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获150多个对CarMV有反应的阳性孔，阳性率为31％。选择10个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得3G1、1B9、2F2、2A9和2F8 5株能分泌抗CarMV的特异性抗体的杂交瘤细胞株。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，5株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。5.单克隆抗体的特异性检测用提纯的香石竹斑驳病毒(CarMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)、芜菁花叶病毒(TuMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、蚕豆萎蔫病毒1(BBWV-1)、蚕豆萎蔫病毒2(BBWV-2)、香石竹环斑病毒(CaRSC)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)1ug/ml包被ELISA反应板，以相应的健叶提取液作阴性对照，用间接ELISA法，分别测定5株单抗的特异性反应。间接ELISA方法具体为上述病毒分别用包被液稀释成1ug/mL后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭30-60min；加入单抗100ul/孔，37℃ 1-2小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100ul/孔，37℃ 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD405的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，5株单抗对CarMV有特异性反应，而与TMV、ToMV、CMV、SCMV、PVY、PVX、BBWV1、BBWV2、TuMV、CaRSC其他病毒均无特异性反应。6.单克隆抗体腹水制备及纯化取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30ul/ml腹水)，室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗香石竹斑驳病毒的单克隆抗体，其特征是，３Ｇ１、１Ｂ９、２Ａ９、２Ｆ８、２Ｆ２５株单克隆抗体腹水的间接ＥＬＩＳＡ效价在１０↑［－６］以上；３Ｇ１、１Ｂ９、２Ａ９、２Ｆ８的单克隆抗体类型及亚类均为ＩｇＧ１，２Ｆ２的单克隆抗体类型及亚类 为ＩｇＧ３；５株单抗分别识别抗香石竹斑驳病毒上５个不同的位点；５株单抗均与抗香石竹斑驳病毒有特异反应，而与其他病毒无交叉反应。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，周雪平，陈正贤，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]