一种检测布鲁氏菌的免疫层析试纸及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测布鲁氏菌抗原的免疫层析试纸及其制备方法。该免疫层析试纸，包括样品垫１、紧密连接于所述样品垫一端的含有布鲁氏菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫２、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜（ＮＣ膜）３和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫４；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线５和质控线６，所述检测线为布鲁氏菌特异性抗体，所述质控线为抗兔抗抗体。本发明专利技术用于临床标本、污染物和环境中布鲁氏菌抗原的检出，也可用于纯培养布鲁氏菌的鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测布鲁氏菌的试纸，特别涉及一种检测布鲁氏菌的免疫层析试纸，还涉及其制备方法。
技术介绍
布鲁氏病是一种人畜共患的传染病，它广泛地分布在世界各地。目前已发现布鲁氏菌属(Brucella)有6个种，包括马尔他布鲁氏菌(Br.Militensis)、流产布鲁氏菌(Br.abotus)、猪布鲁氏菌(Br.suis)、羊布鲁氏菌(Br.ovis)、木鼠布鲁氏菌(Br.neotomae)和狗布鲁氏菌(Br.canis)，其中马尔他布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌和羊布鲁氏菌对人致病。布鲁氏菌(Brucella spp)是革兰氏阴性短杆菌或球杆菌，营养要求苛刻，生长缓慢，初次分离培养需要7天甚至更长时间才可长出肉眼可见菌落。脂多糖抗原是布鲁氏菌的表面抗原，也是布鲁氏菌属中不同种布鲁氏菌的共同抗原。1943年美国开始研究进攻性生物战剂，并在Camp Detrick进行战剂的生产，首次研究并生产的生物战剂的种类包括炭疽杆菌、鼠疫菌、土拉热菌、猪布鲁氏菌、霍乱弧菌、伤寒沙门菌、Q热立克次体、委内瑞拉马脑炎病毒、肉毒毒素和B型葡萄球菌肠毒素等。1954年美国在新建的Pine Bluff兵工厂中第一个武器化的生物战剂即是布鲁氏菌。迄今为止，布鲁氏菌仍作为经典的生物战剂，被列入《国际禁止生物武器公约》生物战剂清单。“9.11”恐怖事件以后，布鲁氏菌在美国国家反恐预案中又被列为可引起生物恐怖的烈性病原微生物。布鲁氏菌可通过气溶胶高度传染，10～100个菌足以使人发病。因此，布鲁氏菌快速检测新技术的研究是防生物战和反生物恐怖袭击的需要。由于布鲁氏菌生长缓慢，在应对由布鲁氏菌引起的生物危害突发事件中，病原体的快速检测显得尤为重要。布鲁氏菌的快速检测主要包括特异性抗原的检测和特异性核酸片段的检测，抗原检测常用的是免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)，核酸检测常用的是聚合酶链反应(PCR)，这些方法的使用已有许多文献报道。但是在实践中，这些方法的使用暴露出一些共同的劣势，例如实验必须在专门的实验室中进行；需要电源和特殊的仪器；操作人员必须经过专门培训；试剂需要冷藏；实验系统不容易标准化，为使结果可信，需要进行多次预试验和设立多项对照；试验操作步骤繁琐，至少需要2小时以上。因此，生物危害突发事件现场条件和对时间的要求使免疫荧光试验、ELISA和PCR等方法的使用受到限制。到目前为止，尚未见到免疫胶体金技术用于检测布鲁氏菌的报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种检测布鲁氏菌的免疫层析试纸(Immuno-Chromatographic Assay，ICA试纸)。本专利技术所提供的检测布鲁氏菌的免疫层析试纸(ICA试纸)，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有布鲁氏菌抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(NC膜)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线为抗布鲁氏菌特异性抗体，优选为兔抗体，所述质控线为抗兔抗抗体。为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还紧密连接有背板。背板的材料可以是多种多样的，如塑料、树脂等。本专利技术的第二个目的是提供一种制备上述检测布鲁氏菌的免疫层析试纸的方法。本专利技术所提供的制备上述检测布鲁氏菌的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤1)布鲁氏菌特异性抗体可按下述方法制备皮下多点注射免疫福氏完全佐剂布鲁氏菌菌体。每只注射2×108cfu菌/ml，共注射3次。玻片凝集试验检测血清效价达到1∶1280以上采血。将布鲁氏菌特异性抗体喷到纤维膜上，包被NC膜的一个区域，得到检测线；将抗兔抗抗体的抗抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥2.5-3.5小时，然后将其一端粘贴在吸水纸垫上；2)制备含有布鲁氏菌特异性抗体标记的免疫胶体金探针溶液；取5～5.5ml，加入0.5～0.55g蔗糖充分溶解，将玻璃纤维或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，-20℃～-50℃放置10-12小时，冻干机抽干即得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的靠近所述检测线的一端；3)在步骤2)中的金标垫上面再贴样品垫，得到检测布鲁氏菌的免疫层析试纸。为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还粘贴背板。本专利技术所提供的检测布鲁氏菌的免疫层析试纸及其制备方法中，所述抗布鲁氏菌特异性抗体标记胶体金探针可由下述方法制备1)将HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下准确加入1.6ml的1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，继续加热煮沸10-12分钟，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，冷却后用水恢复至原体积；2)用K2CO3或HCl调pH值为8.5-9.5，按30μg/ml加入布鲁氏菌特异性抗体，搅拌25-35分钟，配制布鲁氏菌特异性抗体的免疫胶体金探针溶液。然后加入10％BSA 5ml，搅拌20-30分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20-30分钟，20,000-23,500g离心25-35分钟，弃上清，收集沉淀用四硼酸钠保存液收集，得到胶体金标探针。所述调节pH值的K2CO3的浓度可为0.15-0.25M，优选为0.2M；所述调节pH值HCl的浓度可为0.08-0.12mol/L，优选为0.1mol/L。免疫胶体金技术检测布鲁氏菌的基本原理是用抗布鲁氏菌表面抗原的抗体包被硝酸纤维素(NC)膜，用以捕捉标本中的布鲁氏菌或布鲁氏菌抗原，然后用标记了特异性抗体的免疫胶体金探针检测。标本中的布鲁氏菌或布鲁氏菌抗原经过5分钟左右的纸层析后，即出现肉眼可见的沉淀线。该技术与其它方法比较，优势在于检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。本专利技术的免疫层析试纸采用双抗体夹心法，将抗布鲁氏菌特异性抗体包被在硝酸纤维素膜上，用于捕捉标本中的布鲁氏菌抗原，然后用布鲁氏特异性抗体标记的免疫胶体金探针进行检测。本专利技术的试纸可用于临床标本、污染物和环境中布鲁氏菌的检出，也可用于纯培养布鲁氏菌的鉴定。本专利技术的优势在于检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。附图说明图1为布鲁氏菌免疫层析试纸的结构示意图。免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维膜3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线5和质控线6。具体实施例方式实施例一、检测布鲁氏菌的免疫层析试纸的制备1主要材料氯金酸(HAuCl4)，购自Sigma公司，1g/瓶包装。硝酸纤维膜(NC膜)、样品垫和吸水滤纸，购自Millipore公司。塑料背板，北京燕华公司。流产(牛)布鲁氏菌株(保藏号210105)，引自北京生物制品检定所现由军事医学科学院全军微生物检验研究中心菌种库保藏。2方法下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。2.1布鲁氏菌特异性抗体的制备2.1.1布鲁氏菌抗原的制备流产(牛)布鲁氏菌(军事医学科学院微生物流行病研究所菌种库保臧，保藏号210105)接种在胰酶大豆血琼脂(5％本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测布鲁氏菌的免疫层析试纸，包括样品垫（１）、紧密连接于所述样品垫一端的含有布鲁氏菌特异性抗体标记胶体金探针的金标垫（２）、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜（３）和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫（４）；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线（５）和质控线（６），所述检测线为布鲁氏菌特异性抗体，所述质控线为抗兔抗抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：端青，檀华，朱虹，何君，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]