利用O*-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的方法技术

公开了一种使用Ｏ↑［６］－烷基鸟嘌呤－ＤＮＡ烷基转移酶（ＡＧＴ）将标记从底物转移至包含ＡＧＴ的融合蛋白的方法。通过将向融合蛋白引入新的物理或化学性质的分子与该融合蛋白连接，该方法允许在体外和在体内对该融合蛋白进行检测和／或操作。这类分子的例子有光谱探针或报道分子、亲和标记物、产生活性自由基的分子、交联剂、介导蛋白－蛋白相互作用的配体或适用于融合蛋白固定化的分子。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及将标记从底物转移至含有目的蛋白和O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)的融合蛋白中，具体是涉及进一步包括检测和/或操作该标记的融合蛋白的方法。
技术介绍
对复杂的生物系统认识的进展依赖于对基本的生物分子，尤其是蛋白的相互作用的鉴定。尽管越来越多的生物体的DNA测序确定了其开放读框(ORF)，但研究活细胞中相应蛋白的性能，以及鉴定多种蛋白在体内和体外的相互作用的可能性受到限制。大多数针对于实现这种目的的策略是基于融合蛋白的构建，当该偶联蛋白的环境改变时，该融合蛋白会引起物理、生理或化学的反答。这种例子包括酵母-双杂交系统、断裂泛素和绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白。但是，所有这些技术都有不同的限制或缺点。德国专利申请No19903895A(KaiJohnsson)描述了一种ELISA测定方法，用于检测O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)。亲电体，例如N-甲基-N-亚硝基脲的诱变和致癌作用主要是由于DNA中的鸟嘌呤的O6-烷基化。为了防止基DNA烷基化，哺乳动物和细菌具有一种蛋白，即O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)，该酶可修复这种病变〔Pegg等，1995〕。在SN2反应中，AGT将烷基转移到其自身的一个半胱氨酸中，产生不可逆的烷基化的酶。由于AGT在肿瘤细胞中的高表达使其能获得药物抗性，尤其是对烷基化药物，例如，西卡巴肼、达卡巴嗪、泰莫佐罗和双-2-氯乙基-N-亚硝基脲的抗性，AGT的抑制剂已被建议用作化学治疗中的致敏剂〔Pegg等，1995〕。DE 19903895A公开了一种测定AGT水平的分析方法，该方法依赖于生物素化的O6-烷基鸟嘌呤衍生物和AGT之间的反应，该反应导致AGT的生物素化。该反应随后也能使AGT在包被链霉抗生素蛋白的平板上分离出来并对其检测，例如在ELISA测定中。该测定方法已被建议用于监测肿瘤组织中的AGT水平，在化学治疗中用AGT抑制剂作为致敏剂进行调节治疗，以及用于筛选AGT抑制剂。Damoiseaux、Keppler和Johnsson(Chem Biochem，4285-287，2001)公开了掺入寡脱氧核糖核苷酸中的修饰的O6-烷基化的鸟嘌呤衍生物，用作标记AGT的化学探针，更方便了对该酶在癌细胞中水平的检测，以有助于研究和化学治疗。两种类型的各种AGT底物和对生物素标记的AGT的测定己公开(与DE19903895A中所述相同)。此外，还建议在AGT的直接进化中使用这些O6-烷基化衍生物。
技术实现思路
广义地说，本专利技术涉及O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)在标记以及任选随后操作和/或检测系统中蛋白或肤的方法中的进一步用途，在该系统中，蛋白或肽和AGT的融合物与标记的底物接触，使AGT将标记从底物转移至AGT融合物，从而依赖于转移的标记使标记的AGT-蛋白融合物能被操作和检测。这与现有技术的测定方法相反，该测定方法测量不以融合蛋白形式存在的AGT水平。因此，本专利技术的第一个方面是提供一种方法，该方法包括使含有目的蛋白和O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)的融合蛋白与带有标记的底物接触，从而使AGT将标记转移而使其与融合蛋白共价结合。将标记转移至融合蛋白后，该方法可以另外包括进一步检测和操作该标记的融合蛋白的步骤。在一个实施方案中，本专利技术提供一种标记含有目的蛋白和O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)融合蛋白的方法，该方法包括使融合蛋白与带有标记的底物接触，从而使AGT将标记转移而使其与融合蛋白共价结合。在一些实施方案中，该方法包括一个或多个其它步骤，例如检测和/或操作标记的融合蛋白。再一个方面，本专利技术提供一种检测含有目的蛋白和O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)的融合蛋白的方法，该方法包括使该融合蛋白与带有标记的底物接触，从而使AGT将标记转移而使其与融合蛋白共价结合，并利用该标记检测该蛋白构建体。还有一个方面，本专利技术提供一种操作包含目的蛋白和O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)的融合蛋白的方法，该方法包括使该融合蛋白与带有标记的底物接触，从而使AGT将标记转移而使其与融合蛋白共价结合，并利用由标记引入融合蛋白的物理和化学性质而对该融合蛋白加以操作。在本专利技术该方面的一些实施方案中，上述方法可包括用标记检测蛋白构建体。另一个方面，本专利技术提供一种将含有目的蛋白和烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)的融合蛋白固定在固体支持物上的方法，该方法包括使该融合蛋白与带有标记的底物接触，该标记连接或可连接在固体支持物上，其中AGT将标记转移而使其与融合蛋白共价结合，该融合蛋白从而连接或随后可连接到固体支持物上。在本专利技术的实施方案中，其中标记在开始不是连接在固体支持物上时，该方法可进一步包括使标记的融合蛋白与固体支持物接触的步骤，从而使其固定在固体支持物上。在本专利技术这个方面的此优选方案中，标记可以在其被转移，或在随后的反应中与固体支持物共价连接；或者标记可以是特异结合对的成员之一，该特异结合对中的另一成员，通过共价或其他方式(例如，用生物素和抗生素蛋白或链霉素抗生物素蛋白的特异结合对)连接或可连接在固体支持物上。在还有一个方面，本专利技术提供一种在体内以及在体外标记AGT融合蛋白的方法。术语AGT融合蛋白的体内标记包括在细胞的所有区室，以及指向细胞外空间的AGT融合蛋白中进行标记。如果AGT融合蛋白的标记在体内进行，而且与AGT融合的蛋白是质膜蛋白，则融合蛋白的AGT部分可以与细胞质或质膜的胞外侧连接。如果标记在体外进行，融合蛋白的标记可以在细胞提取物中进行，或用AGT融合蛋白的纯化或富集形式进行。在另一个方面，本专利技术提供一种测定候选化合物或候选化合物库和靶物质或靶物质库中的相互关系的方法。所说的化合物或物质的例子包括配体和蛋白、药物和该药物的靶、或小分子和蛋白。在所述方法中，与AGT融合的目的蛋白包含转录因子的DNA结合域或激活域，靶物质或靶物质的库与转录因子的另一个DNA结合域或激活域结合，标记是怀疑与靶物质相互作用的候选化合物或候选化合物库。在优选的实施方案中，该方法可以进一步包括将候选化合物或候选化合物的库转至AGT融合蛋白，并使候选化合物标记的AGT融合蛋白与靶物质接触，从而使与AGT融合蛋白连接的候选化合物与靶物质的相互作用激活转录因子。激活的转录因子然后可驱动报道分子的表达，如果该方法在细胞中进行，可以检测该报道分子的表达是否赋予细胞选择性的优点。在某些实施方案中，该方法可进一步包括一个或多个步骤，例如对侯选化合物或靶物质进行检测、分离、鉴定或表征的步骤。在本申请中，O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶或’AGT’具有将底物上存在的标记转移至AGT的半胱氨酸残基之一上而形成融合蛋白的一部分的性质。在优选的实施方案中，AGT是O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，例如人的O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，该酶在Pegg等，1995及其参考文献中有描述。但是，其他烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶是已知的，如Rog等，1995中所述的鼠科动物或大鼠形式的酶，只要这些酶具有以上定义的性质，则可以用于本专利技术中。在本专利技术中，O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶也包括各种野生型的AGT，它们可能由于1个或多个氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，它包括使包含目的蛋白和Ｏ↑［６］－烷基鸟嘌呤－ＤＮＡ烷基转移酶（ＡＧＴ）的融合蛋白与带有标记的底物接触，从而使ＡＧＴ转移此标记而使其与该融合蛋白共价结合，其中所述标记是一种分子，该分子是固相或与固相连接，或者可与固相连接。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：K约翰松，S根德雷茨，A开普勒，
申请(专利权)人：洛桑生态综合技术联合公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]