用合成探针标记融合蛋白制造技术

本申请的发明专利技术是用合成探针标记融合蛋白。本发明专利技术涉及被称 为烷基胞嘧啶转移酶(ACT)的新蛋白质，其衍生自O6-烷基鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶；ACT的底物，其用于特异性地将标记转移到这些ACT； 以及包含这些的融合蛋白。根据本发明专利技术的底物是式(I)的取代胞嘧啶，如右。 其中，R1是芳族基或杂芳族基，或者是双键连接于OCH2-的任选取代 的不饱和烃基、环烃基或杂环基；R2是连接体；并且L是一个标记或 多个相同或不同的标记。本发明专利技术进一步涉及将标记L从这些式(I)底物 转移到ACT和ACT融合蛋白的方法。ACT-式(I)化合物的系统与已知 系统O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)-苄基鸟嘌呤一起特别适合 于双重标记研究。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及将标记从底物转移到融合蛋白的方法，所述融合蛋白具有特定设计来接受所述标记的蛋白质部分；新的特异性底物以及新的蛋白质，其接受适合于这种方法的特异性底物的标记。
技术介绍
对于改良的标记技术存在持续需求，所述标记技术允许特异性地标记目标蛋白质以便在体外或体内条件下分离和/或跟踪这些目标蛋白质。 一个具体的方法公开在WO 02/083937中，其描述了一种检测和域操纵目标蛋白的方法，其中该蛋白质被融合于0、烷基鸟嘌呤-DNA垸基转移酶(AGT)并且该AGT融合蛋白与携带标记的特异性AGT底物接触，由此该标记被转移到该融合蛋白。该AGT融合蛋白然后利用该标记进行检测并且任选地进一步进行操纵。野生型AGT的几种突变体显示出比野生型AGT( WO 2004/031404; Juillerat, A.等，Chem. Biol.10:313-317， 2003; Gronemeyer， T.等，Protein Eng. Des. Sel. 19:309-316，2006)更适合于这种标记方法，并且宽范围的取代苄基鸟嘌呤和相关的杂芳基甲基鸟嘌呤化合物被描述用于将标记转移到包含AGT和AGT突变体的融合蛋白(WO 2004/031405)。简单的02-苄基-胞嘧啶是已知的。Freccero, M.等，J. Am. Chem.Soc. 125:3544-3553, 2003通过胞嘧啶与邻醌甲基化物(o-quinonemethide)的反应获得02-邻羟基苄基胞嘧啶。Ward, A.D,和Baker, B. R.,J. Med. Chem. 20:88-92, 1977描述了从2-氯-4-氨基嘧啶与苄醇的钠盐获得的02-苄基胞嘧啶。
技术实现思路
本专利技术涉及被称为烷基胞嘧啶转移酶(ACT)的新蛋白质，其衍生自0、烷基鸟嘌呤-DNA垸基转移酶；以及涉及ACT的底物，其特异性地将标记转移到这些ACT以及转移到包含这类ACT的融合蛋白。根据本专利技术的底物是式(I)的取代胞嘧啶，其中，R,是芳族基或杂芳族基，或者是双键连接于OCH2-的任选取代的不饱和烃基、环烃基或杂环基；R2是连接体；并且L是一个标记或多个相同或不同的标记。本专利技术进一步涉及将标记从这些式(I)底物转移到烷基胞嘧啶转移酶(ACT)和ACT融合蛋白的方法。附图说明 SI:包含AGT和ACT的融合蛋白的体外双重标记实验，其利用携带荧光标记的特异性底物苄基鸟嘌呤(BG)和苄基胞嘧啶(BC)进行。实验如下进行用BGFL、 BGCy5、 BCFL、 BCCy5或者BGCy5/BCFL或BGFL/BCCy5的等摩尔混合物温育GST-ACT1和6xHis-NAGT的等摩尔混合物。荧光染料标记的蛋白质混合物通过SDS-PAGE进行分析，参见实施例12。GST-ACT1:ACT 1 (SEQIDNO:l)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。6xHis-AGT: NAGT(SEQIDNO:2)与短肽6xHis的融合蛋白。BGFL和BGCy5:分别用携带荧光素的连接体以及Cy5取代的苄基鸟嘌呤，参见Juillerat, A.等，Chem. Biol.10:313-317,2003，和化合物11 (实施例9) 。 BCFL:化合物5 (实施例4) 。 BCCy5:化合物IO (实施例8)。 利用携带荧光标记(FL)的底物苄基鸟嘌呤(BG)和苄基胞嘧啶(BC)的ACTIO标记实验，证明对BC的选择性。温育不同时间后SDS凝胶实验的荧光读数被显示在上部，其10对应于底部的图。从ACT形成的ACT-荧光素偶联物的百分比(％ ACT-FL)对温育时间(min)被显示。通过用BGFL或BCFL温育0.5 pM的GST-ACT10混合物进行该实验。GST-ACT10: ACT 10 (SEQ ID NO:12)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。BGFL禾卩BCFL:参 见图1的说明。发现的结合常数:kBc^ll30士150MS;kBG 10M-'S-'。 [10] Ml:尿素诱导的ACT1、 ACT9和ACTIO解折叠。 [11]显示的是所形成的ACT-荧光素的百分比(％ACT-FL)。在O M尿素[(NH2)2CO]下所获得的值被设定为100%。蛋白质(0.5 一)在 添加有尿素(O至8M)的动力学缓冲液(kinetic buffer) (50 mM HEPES， pH7.2， 1 mMDTT)中温育30分钟。然后该溶液被调节至20 BCFL 并且温育2小时。样品然后在SDS缓冲液中在95'C下沸腾5分钟(min)。 荧光素染料标记的蛋白质混合物通过SDS-PAGE进行分析。该数据组 用Y= 100/(1 +10、(1(^(:1/200'扭1151(^6))进行拟合，以得到半解折叠尿 素浓度C1/2。对于不同突变体，发现下列Cl/2值ACT1 2.8±0.1 M; ACT9 4.1 ±0.1 M; ACTIO 5.1±0.2 M。具体实施例方式本专利技术涉及称为烷基胞嘧啶转移酶(ACT)的新蛋白质，其衍生 自0、垸基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，特别适合于从式(I)底物转移标记。垸基胞嘧啶转移酶(ACT)被定义为这样的蛋白质(a)由170 至220个氨基酸，优选175至l卯个氨基酸，最优选177至185个氨 基酸组成；(b)包含至少一个半胱氨酸；(c)与02-苄基胞嘧啶进行反 应，由此至少与在相同条件下与06-苄基鸟嘌呤的反应一样快地将苄基 取代基转移至(b)的半胱氨酸的巯基官能上。本专利技术的ACT在基于AGT的噬菌体展示的定向进化方法中 从编码AGT的DNA加以制备。作为基于噬菌体展示的定向进化的起 始点，编码突变体NAGT ( SEQ ID NO:2， Gronemeyer, T.等，Protein Eng. Des.Sel. 19:309-316,2006)的DNA被使用。WAGT对苄基鸟嘌呤衍生 物所展示出的活性比野生型AGT (Juillerat， A.等，Chem. Biol. 10:313-317, 2003)高大约50倍并且它本身已经通过利用噬菌体展示的 定向进化和苄基鸟嘌呤底物获得。残基Tyrll4、Lysl31、Serl35、Va1148、Glyl56、 Glyl57、 Glul59的密码子经由饱和诱变被随机化。噬菌粒 pAK100中的转化产生107个独立克隆的突变体AGT文库。为了选择， 噬菌体文库与作为底物的BCFL——携带荧光素的苄基胞嘧啶(化合物 5)——温育，以标记与苄基胞嘧啶进行反应的突变体。这允许随后通 过利用覆盖有抗荧光素抗体的磁珠富集相应的噬菌体。经过6轮对 BCFL活性的筛选后，克隆ACT1至克隆ACT8通过DNA测序进行分 析(表l，以单字码显示的氨基酸)。在随后的测试中，明显的是，来 自克隆ACT1至克隆ACT8的蛋白质对4 M尿素变性仅显示有限的稳 定性。为了改善这一点，对同一文库进行再筛选。来自最佳分离的克 隆的蛋白质被列为ACT9并且在4 M尿素中显示出良好的稳定性，但 是对苄基胞嘧啶具有有限的反应性。接着，如下获得ACTIO:通过编 码ACT9的DNA的易错PCR，接着进行随后的噬菌体选择，这导致残 基Met60Ile、 A本文档来自技高网...

【技术保护点】
式（Ⅰ）化合物，　＊＊＊　（Ⅰ）　其中，　Ｒ↓［１］是芳族基或杂芳族基，或者是双键连接于ＯＣＨ↓［２］－的任选取代的不饱和烃基、环烃基或杂环基；　Ｒ↓［２］是连接体；并且　Ｌ是一个标记或多个相同或不同的标记。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2006.7.25 EP 06117779.61.式(I)化合物，其中，R1是芳族基或杂芳族基，或者是双键连接于OCH2-的任选取代的不饱和烃基、环烃基或杂环基；R2是连接体；并且L是一个标记或多个相同或不同的标记。2. 根据权利要求1所述的式(I)化合物，其中R,是苯基。3. 根据权利要求2所述的式(I)化合物，其中R,是对位取代的苯基。4. 根据权利要求1所述的式(I)化合物，其中R2是具有1至300个 碳原子的直链或支链亚烃基，其中任选地(a) —个或多个碳原子被氧置换，特别地，其中每隔两个碳原子被 氧置换，例如具有1至100个乙烯氧基单元的聚乙烯氧基；(b) —个或多个碳原子被携带氢原子的氮置换，并且相邻的碳原子 被氧代取代，其代表酰胺官能-nh-co-;(c) 一个或多个碳原子被氧置换并且相邻的碳原子被氧代取代，其 代表酯官能-o-co-;(d) 两个相邻碳原子之间的键是双键或三键，其代表官能-chk:h-或c三c-；(e) —个或多个碳原子被下列基团置换亚苯基、饱和或不饱和的亚环烃基、饱和或不饱和的亚双环烃基、桥连杂芳基或者桥连饱和或不饱和杂环基；(f) 两个相邻碳原子被下列置换二硫键-S-S-;或者两个或多个、尤其两个或三个亚烃基和/或如上文(a)至(f)所定 义的改性亚烃基的组合，其任选地含有取代基。5. 根据权利要求4所述的式(I)化合物，其中R2是具有1至25个 碳原子的直链亚烃基，其中碳原子任选地被酰胺官能-NH-CO-置换。6. 根据权利要求1所述的式(I)化合物，其中L是光谱探针、代表 特异性结合对的一部分的分子或者共价连接于固相支持体的分子。7. 根据权利要求6所述的式(I)化合物，其中L是荧光团。8. 根据权利要求7所述的化合物N-[4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基)-苄基]-四甲基若丹明-5-或6-甲酰胺，或其混合物。9. 根据权利要求7所述的化合物N-[4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基)-苄基]-荧光素-5-或6-甲酰胺，或其混合物。10. 根据权利要求7所述的化合物N-[4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基)-苄基]-二乙酰基荧光素-5-或6-甲酰胺，或其混合物。11. 根据权利要求7所述的化合物，其为式8的N-[4-(4-氨基嘧啶 -2-基氧甲基)-苄基]-0￥647-甲酰胺。<formula>formula see original document page 3</formula>12.根据权利要求7所述的化合物，其为式9的N-[4-(4-氨基嘧啶 -2-基氧甲萄-节基]。丫547-甲酰胺。13.根据权利要求7所述的化合物，其为式10的N-[4-(4-氨基嘧 啶-2-基氧甲基)-苄基]-Cy5-甲酰胺。14.式12的根据权利要求7所述的化合物BC-生物素。15.式13的根据权利要求7所述的化合物BC-PEG-生物素。16.式14的根据权利要求7所述的化合物BC-360。17.式15的根据权利要求7所述的化合物BC-430。18.式16之一的根据权利要求7所述的化合物BC-俄勒岗绿或其 混合物。<formula>formula see original document page 5</formula>19.式17之一的根据权利要求7所述的化合物BC-俄勒岗绿二新20.<image>image see original document page 6</image>21. 烷基胞嘧啶转移酶(ACT)，其是这...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·戈蒂尔，K·约翰松，M·金德曼，A·朱耶拉特，F·博菲尔斯，
申请(专利权)人：洛桑联邦理工学院，
类型：发明
国别省市：CH